在高盐稀态酱油的发酵过程中，蛋白酶是最为重要的酶之一，负责原料的降解和氨基态氮的生成，直接决定了酱油的品质。高盐稀态酱油的酱醪阶段由于其高盐环境抑制了蛋白酶的活性，导致发酵周期长达6个月，大大制约了酱油产业的发展。因此，掌握蛋白酶在高盐环境下的催化机理对于酱油酿造工艺的改良具有重要意义。本论文以米曲霉菌株(Aspergillus oryzae CICIM F0899)为研究对象，研究了蛋白酶在高盐环境下的催化动力学及酶稳定性热力学。将米曲霉及其耐高盐蛋白酶在高盐稀态酱油酿造中的应用进行了研究，主要研究内容总结如下：(1)以一株可以产生耐高盐蛋白酶的米曲霉菌株为基础，研究了酶学性质及水活度对米曲霉分泌蛋白酶的影响。首先，研究了米曲霉F0899和沪酿3042产蛋白酶的过程及酶学性质，发现蛋白酶的分泌主要集中在18～30h；两者所合成的蛋白酶均在40℃以下保持稳定，最适反应温度分别为50℃和60℃；均在pH6.0～8.0保持稳定；蛋白酶活性随着盐浓度的增加而下降，米曲霉F0899蛋白酶的耐盐性明显高于沪酿3042蛋白酶，在18%氯化钠浓度下酶活仍保留20%，是沪酿3042的2.2倍。三种水活度控制剂的添加都对米曲霉的生长和产酶有影响，其中以氯化钠最为明显。(2)研究了温度和初始水分含量交互作用对米曲霉生长和产蛋白酶的影响，并构建了动力学模型。使用Logistic模型描述温度和水分对米曲霉菌体的生长，使用Ratkowsky模型描述温度对比生长速率的影响，使用二次多项式描述水分同最大生物量的关系。在30℃和50%水分(湿基)时，菌体最大比生长速率为0.1671/h，最大生物量为211mg/g。蛋白酶的分泌同菌体的生长属于偶联型。经过验证，该模型具有较好的适用性。在自制的固态发酵反应器中进行小试，取得了良好的效果，蛋白酶活力达到了1560U/g。(3)分离得到了一种中性蛋白酶，构建了该酶在高盐环境下的催化动力学模型，并同木瓜蛋白酶进行了比较。首先，通过硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析和凝胶层析的方法对耐高盐蛋白酶进行了纯化。该蛋白酶为中性蛋白酶，分子量约为50kDa。构建了融合德拜-休克尔定律的高盐动力学模型，发现高盐环境既影响米曲霉蛋白酶的米氏常数Km又影响转换数kcat，从而影响蛋白酶的活性，随着离子强度的增大，Km增大而kcat变小，高盐环境对酶参数的影响符合一级动力学模型。但高盐环境对木瓜蛋白酶的影响方式存在明显不同：离子强度对米氏常数Km影响较小，但显著影响转换数kcat。通过对两种蛋白酶结合中心、催化中心的保守序列以及氨基酸全序列进行分析，发现高盐环境对酶活性的影响存在差异主要是由于酶结合中心、催化中心及全序列特征造成的。动力学的分析结果同序列分析的结果相一致。(4)从热力学角度揭示了高盐环境对提高蛋白酶稳定性的机理。研究了温度和盐度对米曲霉耐高盐蛋白酶热失活行为的影响，发现在45~70℃范围内，随着氯化钠浓度的增加，蛋白酶的半衰期显著延长。在24%盐度和60℃下，半衰期达到了30min，是无盐条件下的2.11倍。在高盐浓度下蛋白酶的吉布斯自由能和热失活能均高于无盐和低盐浓度下。在24%氯化钠浓度条件下，吉布斯自由能和热失活能分别增加了2.1和4.75kJ/mol。通过圆二色光谱分析，发现盐浓度会显著影响蛋白酶的二级结构，当氯化钠浓度从0%增加到6%和18%时，α螺旋的比例明显增大，从3.2%增加到了9.3%和31.7%。在pH4.0时，添加18%的氯化钠可使蛋白酶的半衰期从4.3d增加到7.2d，在pH5.0时，添加18%的氯化钠也可使半衰期延长3d。通过添加高浓度的氯化钠不仅可以提高蛋白酶的热稳定性，同时还可以提高中性蛋白酶的在酸性条件下的稳定性，这一特性有利于在酱油发酵中发挥作用，并提高酱油的品质。(5)研究了米曲霉F0899的高盐稀态酱油酿造过程，并提出了在酱醪阶段添加耐高盐蛋白酶的策略。结果表明在酱醪发酵阶段，微生物代谢产酸使酱醪pH持续下降，影响了蛋白酶的活性，导致酱油中氨基态氮和风味物质含量的变化，在180天时氨基态氮含量达到0.62g/100ml，比沪酿3042高11.1%。利用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术对挥发性成分进行了分析鉴定，检测出酱醪中7大类共49种挥发性化合物，其中，酯类、杂环类化合物的含量明显高于沪酿3042，而醛类物质的含量相对较少。通过和沪酿3042进行比较，发现从蛋白酶在高盐环境下的活力、稳定性、酿造酱油的氨基酸组成和挥发性成分等方面，米曲霉F0899均明显优于沪酿3042，在酱油酿造产业中具有更大的潜力。在沪酿3042和米曲霉F0899的酱醪发酵初期添加米曲霉F0899分泌的耐高盐蛋白酶，可以明显提高氨基态氮和游离氨基酸的含量，在发酵两个月时，氨基态氮分别提高了5.05%和4.55%。