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酪氨酸酶是一种含铜需氧酶,广泛存在于微生物、动植物及人体中,具有多种特征性催化活性和生理功能,同时酪氨酸酶也是决定动物毛色、肤色和虹膜颜色的重要基因,受到国内外诸多学者的广泛关注。我国毛皮动物的拥有量巨大,近年来,国内外市场对毛皮品质要求越来越高,毛色是决定毛皮品质的重要性状之一,探讨其毛色的调控机制对人工提高毛皮经济动物的经济性状有重要意义。酪氨酸酶的主要功能是促进黑色素的生成,除了其对毛皮动物的经济价值外,酪氨酸酶基因突变可以引发白化病的发生。白化病是一类遗传性疾病,其主要的临床表现为皮肤和眼睛的色素缺失及视力障碍等特征。中国人群白化病的总体发病率为1∶18000,且白化病患者的视觉系统受损是无法有效修复或逆转。因此,明确酪氨酸酶的致病机理对于白化病临床相关治疗极为重要。CRISPR RNA引导的Cas9核酸酶基因靶向系统,即CRISPR/Cas9系统,已被广泛用于编辑多种生物的基因组。在本研究中,我们利用高效成对的sg RNA及CRISPR/Cas9系统对家兔TYR基因的多个位点分别进行了突变,包括敲除及敲入实验。主要分为整体TYR基因全基因105kb敲除,对TYR基因的3’UTR区进行敲除调控及对TYR基因SNP位点进行定点修复,并对其调控及作用机理进行研究。首先,通过CRISPR/Cas9系统,我们成功获得了TYR全基因105kb敲除兔,结果表明,TYR全基因敲除兔具有皮肤毛色白化现象。在该家兔的F1代中发现了具有相同基因型和白化症状的家兔,表明TYR基因可直接影响黑色素的生成,进而导致皮肤及虹膜白化现象的发生,同时说明CRISPR/Cas9系统可高效进行全基因缺失并稳定遗传到子代。另外,m RNA的3’UTRs被认为在RNA复制和蛋白质翻译中起重要作用。然而目前却没有相关的动物实验证明。因此我们通过CRISPR/Cas9系统在家兔上对TYR基因的3’UTR区域进行调控,观察其毛色变化。结果显示在TYR基因3’UTR突变兔中发现毛发和虹膜的泛灰色和黑色素减少,该家兔的F1代也发现了毛发和虹膜灰色表型,说明TYR基因的3’UTR区缺失造成TYR基因表达下降,从而造成黑色素生成量减少。因此我们提供了第一份动物实验证明,3’UTR对TYR基因的表达及动物毛色起重要调控作用,同时说明CRISPR/CAS9系统可在将来促进UTR或非编码RNA的基因型到表型的研究。最后,我们利用CRISPR/Cas9系统对白兔TYR基因上对毛色影响最常见的突变位点1118位置(T373K)进行点突变,成功获得TYR基因SNP(T373K)敲入兔,其毛色和虹膜呈现黑色,且毛色白化症状得到明显改善。该表型可稳定遗传到F1代。通过体外实验我们确定TYR基因突变主要造成其酶中心的铜离子结合位点失效,使其酪氨酸酶活性减低,造成黑色素生成受阻,从而引起毛色变白。同时也说明CRISPR/Cas9系统可在动物体内有效应用于基因治疗等相关研究。综上所述,在动物体内酪氨酸酶基因的表达量及活性调控了毛色色素沉着过程,直接影响毛色表型。并证明CRISPR/Cas9系统可在动物体内高效进行全基因缺失,UTR区域,非编码RNA区域敲除及点突变等应用。