膀胱癌是我国泌尿外科最常见的肿瘤之一,占全身恶性肿瘤发病率的第八位,其特点是术后复发率高,严重威胁着人类的健康和生命。目前膀胱癌的治疗以手术切除为主,放、化疗为辅,但其疗效并不确定,特别是对于大多数中晚期膀胱肿瘤,尤其伴有局部扩散或远处转移者,目前的治疗效果均不理想。随着分子生物学技术及基因工程的发展,肿瘤的分子生物学机制得到进一步的阐明,肿瘤的基因治疗技术也随之迅速发展,为膀胱癌的治疗提供了一种新的且具有希望的手段。肿瘤的基因治疗是指在基因水平上通过载体系统将治疗基因导入肿瘤及其相关组织并有效表达从而达到治疗目的。肿瘤的基因治疗根据治疗机理不同,目前可分为免疫基因治疗、纠正性基因治疗、自杀基因治疗、反义核酸治疗、耐药基因治疗、联合基因治疗等。其中自杀基因(suicide gene)治疗备受关注,是一种有效和具有临床应用潜力的治疗策略。自杀基因治疗是将编码某些特定酶的基因导入肿瘤细胞,这些酶可将无活性或低毒的药物前体转化为具有较强细胞毒性的药物,从而杀死肿瘤细胞。HSV-tk/GCV是研究最为深入的一种自杀基因系统,HSV-tk酶可将GCV磷酸化为GCV一磷酸,继而在哺乳动物细胞TK酶的催化下最终转化为GCV三磷酸,抑制DNA聚合酶的活性,掺入DNA合成,产生细胞毒性。而且研究发现该方法还具有“旁观者效应”,即转染细胞可以杀死附近未转染细胞的特性,从而弥补转染效率低的缺陷,发挥更强大的治疗作用。肿瘤细胞的无限增殖是恶性实体瘤的主要特性。肿瘤的无限增殖能力主要靠端粒酶的激活来不断地维持端粒的长度而达到的。端粒酶在大多恶性肿瘤细胞中处于激活状态而在正常细胞中却没有活性或者活性很低,是目前所报道最为广谱的肿瘤生物分子标记。人端粒酶逆转录酶(human telomerase transcriptase,hTERT)是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位,它的表达调控在转录水平上。利用hTERT启动子来调控病毒携带的目的基因,理论上可以使病毒选择在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达目的基因。我们以往的实验证明,与GCV联合作用下,hTERT启动子控制下的HSV-tk基因的表达能特异地杀伤膀胱癌253J细胞,而对正常细胞MRC-5无明显杀伤作用,且具有明显的旁观者效应;异种动物移植253J细胞后,HSV-tk/GCV系统对体内膀胱肿瘤的生长也有明显的抑制作用;Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对肿瘤的杀伤及抑制作用随着GCV剂量的增加而增强。但由于GCV的细胞毒性较大,使其临床应用将受到一定限制。在此基础上,我们设立本课题研究,在构建出hTERT启动子调控的携带自杀基因HSV-tk的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk基础上,通过体外和体内实验,将Scopadulciol(SDC)与Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,对其选择性杀伤肿瘤细胞的效果进行评估,观察SDC对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统肿瘤杀伤作用的增强效应,并对其抗肿瘤机制进行初步探讨。本实验共分三个部分。一、hTERT启动子调控的HSV-tk基因重组腺病毒载体的构建目的:构建一种受hTERT启动子调控的、腺病毒介导的自杀基因转移系统Ad-hTERT-HSV/tk。方法:利用DNA重组技术,首先构建一种携带hTERT启动子和HSV/tk基因的重组腺病毒质粒,然后在293细胞包装成携带受hTERT启动子调控HSV/tk基因表达的重组腺病毒ad-hTERT-HSV/tk。同时构建CMV启动子调控的、携带自杀基因HSV/tk的重组腺病毒Ad-CMV-HSV/tk以及携带报告基因EGFP的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP作为对照。应用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取腺病毒DNA,对该4种病毒进行PCR鉴定。腺病毒的扩增及纯化采用293细胞及氯化铯纯化常规方法,病毒滴度测定采用TCID50法。结果:成功构建了4种重组腺病毒Ad-CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP,按需要在293细胞内扩增后以氯化铯密度梯度离心法进行纯化,TCID50法测得病毒滴度分别为4×1010pfu/ml,1×1011pfu/ml,1.2×1011pfu/ml和3.7×1010pfu/ml。二、Scopadulciol对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统杀伤253J细胞增效作用的体外试验研究目的:我们将SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,通过体外实验观察该系统对膀胱癌253J细胞的杀伤作用,深一步研究SDC对重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统在杀伤膀胱癌细胞中的增效作用。方法:(1)细胞培养:膀胱癌细胞253J培养取含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640培养基;人正常肺成纤维细胞株MRC-5取MEM培养基;置5%CO2孵箱中,饱和湿度及37℃培养。(2)观察SDC对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统体外杀伤膀胱癌细胞的增效作用:将253J以及MRC-5细胞分别接种于24孔板中,每孔3×104个细胞,将两种细胞分为6组,即Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC组、Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组、单纯Ad-hTERT-HSV-tk组、GCV+SDC组、单纯GCV组、单纯SDC组,空白对照以PBS替代。各组分别加入或不加入上述重组腺病毒(MQI=100),5%CO2孵箱37℃培养90分钟,更换完全培养液,24小时后分别加入5%血清培养液含GCV100μmol/L,含SDC0.1μmol或5%血清培养液含GCV100μmol/L或含SDC0.1μmol ,37℃,5%CO2孵箱培养,每种情况均重复3孔,继续培养48小时,四唑盐比色试验法(MTT)测定细胞生长存活率。(3)SDC对不同配伍浓度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用:将生长良好的膀胱癌细胞253J以及正常的成纤维细胞MRC-5分别按1×104个细胞/孔接种于96孔板;培养24h后,按MOI=100加入Ad-hTERT-HSV-tk,每30min轻摇一次;24h后分别加入5%血清培养液含GCV(0、1、10、100、1000μmol/L),含SDC(0、0.04或0.1μmol), 37℃5%CO2孵箱培养;每3d换一次上述培养液,6d后,四唑盐比色试验法(MTT)测定细胞存活率,分别比较不同浓度的GCV、SDC杀伤效果的差异。(4)体外旁杀伤效应观察:将Ad-hTERT-HSV-tk按MOI=100转染253J细胞;24h后将上述肿瘤细胞和未转染Ad-hTERT-HSV-tk的肿瘤细胞以不同比例混合培养,共分5组(0、30%、50%、70%、100%);在5组253J肿瘤细胞培养液中分别加入GCV使其浓度为100μmol/L或浓度为100μmol/L的GCV联合应用SDC0.04μmol,空白对照组未按相同转染比例混合后以PBS替代GCV和SDC,每种情况重复3孔;6d后分别进行MTT测定细胞存活率,比较杀伤效果。结果:(1)重组腺病毒对253J和MRC-5细胞的转染效率倒置荧光显微镜下观察显示,加入重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP,MRC-5细胞未见明显荧光表达。而Ad-hTERT-EGFP对253J细胞的转染率随重组腺病毒的MOI增高而增加,当MOI为0时,无荧光表达;MOI为1时,仅少数细胞有荧光(7.5%);MOI为10时,40.7%的253J细胞EGFP表达阳性;MOI=100时,88.3%的253J细胞EGFP表达阳性;MOI=1000时,所有细胞均出现荧光。提示Ad-hTERT-EGFP对两细胞的转染率有明显差异。(2)SDC对HSV-TK激酶作用的GCV在膀胱肿瘤基因治疗中的增效作用:Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC组253J细胞存活率明显低于MRC-5细胞(P<0.001);Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组253J细胞存活率亦低于MRC-5细胞(P<0.001);单纯Ad-hTERT-HSV-tk组、GCV+SDC组、单纯GCV组、单纯SDC组,对两种细胞株均无明显的杀伤作用。Ad-hTERT-HSV-tk + GCV + SDC组253J细胞存活率明显低于Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组(P<0.01)。(3)SDC对不同配伍浓度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV对膀胱肿瘤细胞体外旁杀伤效应:以MQI=100的Ad-hTERT-HSV-tk感染253J细胞后,不同浓度的GCV联合应用不同剂量SDC,作用于253J细胞,结果显示,GCV联合应用SDC后,253J细胞的存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示Ad-hTERT-HSV-tk+GCV对253J细胞的杀伤作用随着GCV浓度的增加而逐渐增强的基础上,联合应用SDC后,对253J细胞的杀伤作用有明显增强作用。(4)体外旁杀伤效应的观察:tk阳性的253J细胞所占比例分别为0、30%、50%、70%、100%的几组253J细胞,经GCV和/或SDC作用后,结果提示,丙氧鸟苷在杀死tk阳性253J细胞的同时,也可以杀死与其共同培养的tk阴性253J细胞,随着tk阳性253J细胞比例的增加,混合细胞的存活数量明显减少(P<0.05);其联合应用SDC后,杀伤作用又有明显增强。三、Scopadulciol对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的体内实验研究目的:我们将SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,通过体内实验观察该系统对膀胱癌253J细胞的杀伤作用及抑制肿瘤生长作用,深一步研究SDC对重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统在杀伤膀胱癌细胞中的增效作用。方法:(1)裸鼠膀胱癌模型的建立及分组:将膀胱癌细胞用无菌生理盐水配成1×107细胞/ml的细胞悬液。在小鼠右前肢腋窝皮下注入0.2m1细胞悬液。观察小鼠肿瘤生长情况,当肿瘤生长至直径约为6mm和/或体积为100mm3时,将荷瘤裸鼠随机分为4组,每组4只, A组为Ad-hTERT-HSV/tk+GCV+SDC组;B组为Ad-hTERT-HSV/tk+GCV组;C组为Ad-hTERT-HSV/tk+SDC组;D组为对照组,裸鼠体内每天仅注射PBS。(2)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC治疗肿瘤的疗效观察:肿瘤生长抑制的观察:自注射药物开始,每7天用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤的体积,描绘肿瘤的生长曲线,共观察6周。观察结束后处死裸鼠,解剖观察瘤体的大体形态,取对照组和治疗组的肿瘤组织称重。按(1-治疗组重量/对照组重量)×100%计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC对荷瘤裸鼠膀胱癌的生长抑制的影响:BALB/C裸鼠皮下接种253J细胞2周后,可见所有的裸鼠均有肿瘤生长,成瘤率为100%,肿瘤直径约0.5cm-0.6cm。选用瘤体大小一致的裸鼠分组实验,可见C、D各组裸鼠肿瘤生长迅速,瘤的体积无显著性差异(p>0.05),根据肿瘤的体内生长曲线,C、D各组的肿瘤均呈持续快速生长,生长曲线大致相同(p>0.05);B组肿瘤生长受到明显抑制,与C、D两组相比,具有显著性差异(P<0.01);A组抑制肿瘤作用明显,随着治疗进展,肿瘤生长呈停滞或缩小趋势,与B组相比具有显著性差异(P<0.01),与C、D两组相比差异显著性更为明显(P<0.001)。结论1、本研究成功构建了分别由hTERT启动子和CMV启动子调控的携带HSV-tk基因和EGFP基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-EGFP和Ad-CMV-EGFP。对其进行纯化、扩增后具有较高滴度。2、通过体外实验证明,联合应用GCV情况下,hTERT启动子控制下HSV-tk基因的表达能特异地杀伤膀胱癌细胞253J,在此基础上,该系统联合应用SDC后,Ad-hTERT-HSV/tk/GCV系统对膀胱癌细胞253J的杀伤作用又有了明显的增强。3、通过体内实验证明,联合应用SDC后,Ad-hTERT-HSV/tk/GCV系统对膀胱癌细胞253J的杀伤作用及对肿瘤生长的抑制作用也有明显的增强。