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目的:1.研究POP盆底支持组织中细胞外基质代谢及氧化-抗氧化状态;2.研究机械力作用于人盆底成纤维细胞后,细胞凋亡、氧化应激状态、ECM代谢的变化情况,探索机械力在POP发病中的作用;3.研究GPx1在机械力诱导的人盆底成纤维细胞氧化损伤及ECM代谢与重构中的保护作用。方法:第一部分:59例子宫切除患者,分为对照组(Non-POP)、轻度POP组(POPⅠ～Ⅱ)、重度POP组(POP Ⅲ～Ⅳ)三组,分别于术中切取三组患者部分子宫骶韧带组织。通过Masson染色检测各组骶韧带组织的胶原纤维组织病理学改变,Western B1ot和qRT-PCR检测各组骶韧带组织细胞外基质代谢相关因子及GPx1表达水平,免疫组化染色检测各组骶韧带组织氧化-抗氧化状态;第二部分:对因CIN Ⅲ或宫颈原位癌行子宫全切术的10例患者于术中取切除子宫的骶韧带组织标本,对获取的新鲜组织立即行原代成纤维细胞培养,并进行免疫细胞化学染色鉴定,留取第4～8代细胞进行后续实验;第三部分:制备携带GPx1目的基因的过表达载体克隆,经扩增、转化、抽提、慢病毒包装及质量检测后,感染人盆底成纤维细胞,经puromycin筛选稳定转染细胞并采用Western blot鉴定目的基因在盆底成纤维细胞蛋白水平的表达情况;第四部分:建立机械力加载细胞模型。将实验细胞分为三组,NT组(non-transfection group):即 未转染组;MT 组(mock-vehicle transfectoion group)即空载体转染组;GT 组(GPx1 overexpression transfection group)即 GPx1 过表达组,选取LV-GPx1稳定转染细胞。分别对三组细胞进行不同模式力学加载。加力完成后收集细胞样本。采用JC-1和流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位和凋亡率变化,ROS和免疫荧光染色检测各组细胞内氧化应激状态,Western blot和qRT-PCR检测各组细胞外基质代谢相关因子表达情况。结果:第一部分:随着POP患者临床分度增高,POP盆底支持组织中总胶原纤维含量递减,Co11agen I、Co11agen III 及 E1astin 含量显著下降,MMP-2 和 MMP-9 呈显著上升趋势,TIMP-2表达显著下降;同时POP组织中8-OHdG和4-HNE表达增高,抗氧化指标GPx1表达水平下降。第二部分:采用改良的胰酶消化法成功原代培养出盆底成纤维细胞,光镜下观察细胞以长梭形为主,也可见到不规则三角形和多边形,细胞彼此间连接成网状或旋涡状。免疫细胞化学染色显示中间纤维波形蛋白(vimentin)阳性,角蛋白(cytokeratin)染色阴性。第三部分:构建的慢病毒过表达载体(LV-GPx1)阳性克隆序列与目的基因GPx1相符;慢病毒载体感染人盆底成纤维细胞的最佳条件为在含5 μg/m1 Po1ybrene的常规培养基中进行感染,MOI为30,感染时间为48h左右;0.8ug/m1 puromycin为筛选稳定细胞株的最佳抗生素浓度;Western b1ot检测结果显示LV-GPx1慢病毒过表达载体感染人盆底成纤维细胞后可实现目的基因在蛋白水平的高表达;第四部分:与未加力组相比,经5333 μX41h机械力干预下,盆底成纤维细胞内线粒体膜电位下降,凋亡增加,氧化应激水平升高,Ⅰ、Ⅲ型胶原、E1astin合成显著减少,并伴随MMP-2、MMP-9表达上升,TIMP-2、TGF-β1含量降低,盆底成纤维细胞呈现出氧化-抗氧化水平失衡及细胞外基质代谢失衡状态;上调GPx1基因后可减少机械力诱导的细胞凋亡和氧化应激损伤,缓解ECM代谢异常。结论:POP患者韧带组织呈现出ECM代谢异常和重构,以及氧化-抗氧化失衡状态;上调GPx1基因可通过减少细胞凋亡、抑制氧化-抗氧化失衡及ECM代谢失衡等方面,在机械力诱导盆底成纤维细胞损伤的过程中发挥保护作用,结合课题组的前期研究成果,我们可以推断:机械力可诱导氧化应激发生,使盆底支持组织成纤维细胞发生ECM重构从而参与POP的发生发展,而GPx1的抗氧化作用在这一过程中起重要的调控作用,氧化-抗氧化平衡状态是决定POP发生的关键因素;同时GPx1基因过表达在预防盆底成纤维细胞机械损伤中的作用为POP的临床防治提供了新的治疗前景。