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1目的利用体外动物实验和细胞实验,明确食慈姑多糖（SSP）对H2O2诱导离体晶状体浑浊和人晶状体上皮细胞（HLEB3）损伤的抑制作用及其相关作用机制,以期为开发以慈姑为原材料、用以防治年龄相关性白内障的中医食疗保健产品提供实验依据。2方法2.1体外动物实验2.1.1离体兔晶状体实验（1）H2O2诱导离体兔晶状体浑浊模型的建立将透明兔晶状体随机分为正常对照组以及不同浓度H2O2处理组（含200μM、400μM、800μM、1600μM及3200 μM H2O2）,培养24小时和48小时后对各组晶状体进行拍照,观察对比晶状体浑浊度的变化,并利用Image J软件计算相对灰度值。（2）SSP发挥离体兔晶状体浑浊抑制作用的最佳时间和剂量将透明兔晶状体随机分为正常对照组、H2O2损伤模型组（3200μM H2O2培养24小时）以及0.5 mg/mL及1 mg/mL SSP干预组（提前干预24或48小时）,拍照记录各组晶状体浑浊度的变化,并利用Image J软件计算其相对灰度值。此外,利用倒置显微镜观察正常对照组、3200μM H2O2损伤模型组和1 mg/mL SSP干预24小时组晶状体组织的内部变化。2.1.2离体大鼠晶状体实验（1）利用离体大鼠晶状体浑浊模型再次确证SSP的抑制作用将透明晶状体随机分为正常对照组、损伤模型组（400μM H2O2培养24小时）、以及SSP低、中、高剂量组（0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL提前干预24小时）。在加入H2O2后的0小时、12小时和24小时拍摄记录各组晶状体浑浊情况。实验结束对晶状体进行分级,并采用HE染色检测各组晶状体组织病理变化,确定SSP发挥抑制作用的最佳剂量。（2）SSP对离体大鼠晶状体浑浊的抑制作用机制研究随机选择正常对照组、损伤模型组和SSP最佳干预组的晶状体,利用试剂盒检测各组SOD、CAT活力和MDA含量,Western Blot法检测Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的表达水平,来考察SSP对离体大鼠晶状体Nrf2依赖的抗氧化系统的调控。利用试剂盒检测总巯基、可溶性蛋白和不溶性蛋白的含量,GSH-px活力,以及GSH/GSSG的水平;利用Western Blot法检测Grx1、Trx、Trx2和GR蛋白的表达水平,来考察SSP对离体大鼠晶状体蛋白质谷胱甘肽化的调控作用。利用Western Blot法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达水平,同时计算Bcl-2/Bax 比值来考察SSP对离体大鼠晶状体细胞凋亡的抑制作用。2.2细胞实验2.2.1 SSP对H2O2诱导的HLEB3细胞增殖率的作用采用CCK-8法,首先考察不同剂量SSP的毒性作用,进而确定H2O2诱导HLEB3细胞损伤的最佳时间和最佳剂量,最后检测不同剂量SSP（0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL）对HLEB3细胞增殖率的影响,确定SSP发挥保护作用的最佳时间和最佳剂量。2.2.2 SSP对H2O2诱导的HLEB3细胞损伤抑制作用的机制研究将细胞分为正常对照组、损伤模型组（400μMH2O2）以及SSP最佳干预组（1 mg/mL）进行如下研究:通过检测各组细胞中SOD、CAT活力,MDA、ROS含量,以及Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达的水平,来考察SSP对HLEB3细胞Nrf2依赖的抗氧化系统的调控。利用试剂盒检测各组细胞中总巯基、可溶性蛋白和不溶性蛋白的含量,GSSG/T-GSH水平,以及GSH-px活性;利用Western Blot法检测各组细胞中Grx1、Trx和GR蛋白的表达水平,来考察SSP对HLEB3细胞蛋白质谷胱甘肽化的调控作用。利用Hoechst 33342荧光染色法以及Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞的凋亡情况;利用Western Blot法检测各组细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达水平,来考察SSP对HLEB3细胞凋亡的调控作用。2.2.3 Nrf2基因沉默验证SSP对HLEB3细胞的保护作用（1）构建Nrf2基因沉默的HLEB3细胞采用 siRNA 转染技术,利用 NFE2LE-homo-1305、NFE2LE-homo-1753 和NFE2LE-homo-1974三组序列沉默HLEB3细胞中Nrf2基因,采用Western Blot检测Nrf2蛋白的表达情况,选择沉默效果最好的序列进行后续实验。（2）利用Nrf2基因沉默验证SSP对HLEB3细胞的保护作用将细胞分为阴性对照组、沉默对照组、沉默模型组以及沉默干预组,利用NFE2LE-homo-1753序列构建Nrf2基因沉默细胞模型,随后进行SSP保护和H2O2干预,采用Western Blot检测各组细胞中Nrf2、Keap1、HO-1、Grx1、Trx和GR蛋白的表达,来验证SSP对HLEB3细胞抗氧化和蛋白质谷胱甘肽化的调控与靶向调控Nrf2密切相关。3结果3.1体外动物实验3.1.1 SSP对离体兔晶状体浑浊的抑制作用本研究发现经不同浓度H2O2处理24小时后,各浓度晶状体均出现浑浊,且浑浊度随H2O2浓度增高而增高;0.5 mg/mL和1 mg/mL剂量SSP均能有效延缓3200μM H2O2诱导的离体兔晶状体浑浊的发展（P＜0.05）,以1 mg/mL SSP提前干预24小时的延缓作用最佳。3.1.2 SSP对离体大鼠晶状体浑浊的抑制作用及其机制研究通过成功复制第二种离体晶状体浑浊模型（大鼠）,再次验证SSP对晶状体浑浊具有肯定的抑制作用,且1 mg/mL SSP提前干预24小时保护作用最佳;HE染色病理分析发现,提前给予SSP可有效缓解晶状体上皮细胞发生肿胀、空泡化甚至破裂等损伤。与损伤模型组相比,SSP可提高SOD、CAT的活力以及Nrf2、HO-1蛋白的表达,降低MDA含量和Keap1的表达（P＜0.05）,提示SSP对离体大鼠晶状体浑浊的延缓作用与调控Nrf2依赖的抗氧化系统密切相关。与损伤模型组相比,SSP可提高晶状体中总巯基和可溶性蛋白的含量,GSH-px活力,GSH/GSSG水平,以及Grx1、Trx、Trx2和GR蛋白的表达水平,并降低晶状体中不溶性蛋白的含量（P＜0.05）,提示SSP对离体晶状体浑浊的抑制作用与调控蛋白质谷胱甘肽化密切相关,即通过调控Grx和Trx系统,促进蛋白质二硫化物混合物的还原,恢复晶状体中巯基的水平以阻止不溶性蛋白的积聚。与损伤模型组相比,SSP可有效抑制Bax、Caspase-3的蛋白表达,同时上调Bcl-2蛋白的表达和Bcl-2/Bax的比值（P＜0.05）,提示SSP对离体晶状体浑浊的抑制作用与调控晶状体中细胞凋亡密切相关。3.2细胞实验首先,细胞增殖率结果显示,SSP浓度范围0.125 mg/mL～2 mg/mL对细胞增殖率无明显影响（P＞0.05）;400μMH2O2作用24小时为构建HLEB3细胞损伤模型的最佳浓度和时间;1 mg/mL SSP提前干预24小时为SSP发挥HLEB3损伤细胞保护作用的最佳剂量和时间（P＜0.05）。随后,检测各组氧化损伤、蛋白质谷胱甘肽化和细胞凋亡相关指标结果提示,SSP对HLEB3细胞各指标的调控趋势与离体大鼠晶状体相关指标相同;同时,Hoechst 33342染色显示SSP可减少含致密蓝色颗粒状的细胞数目,且Annexin V-FITC/PI法检测的干预组活细胞也明显高于损伤模型组,再次佐证SSP可抑制细胞凋亡的发生。上述结果说明SSP对H2O2诱导HLEB3细胞损伤的抑制作用也与调控Nrf2依赖的抗氧化系统、蛋白质谷胱甘肽化和细胞凋亡密切相关。最后,本研究发现NFE2LE-homo-1753序列对HLEB3细胞中Nrf2蛋白的沉默效果最佳。SSP可有效提升Nrf2基因沉默的HLEB3细胞中Nrf2、HO-1、Grx1、Trx和GR蛋白的表达水平,并降低Keap1蛋白的表达（P＜0.05）,验证了 SSP通过靶向调控Nrf2来发挥其保护作用。Nrf2蛋白的表达水平与抗氧化能力和蛋白质谷胱甘肽化之间有必然联系。4结论慈姑中的主要有效成分SSP可有效延缓离体晶状体浑浊的进展,保护受损HLEB3细胞,其具体保护机制或与靶向调控Nrf2,上调Nrf2依赖的抗氧化系统,阻止晶状体中蛋白质持续单向谷胱甘肽化,阻止晶状体上皮细胞发生凋亡相关。