Cry1Ac抗、感棉铃虫中肠BBMV分离、纯化及其与Cry1A的结合模型

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棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)是世界性重要农业害虫,随着转Bt基因棉花种植面积的快速增长,棉铃虫对Bt的抗性研究日显重要。本研究在获得CrylAc抗性棉铃虫的基础上,分离、纯化了棉铃虫中肠BBMV(Brush Border Membrane Vesicles,BBMV),并着重研究了三种CrylA毒蛋白与抗、感品系棉铃虫中肠BBMV的结合动力学,构建了抗、感品系BBMV与三种CrylA蛋白间的结合模型,主要结果如下: 利用差速离心法,分离了CrylAc抗、感棉铃虫品系中肠BBMV。通过SDS-PAGE电泳发现:敏感品系的蛋白条带较抗性的多,其大小主要集中在53~170kDa之间,其中敏感品系中存在一条抗性品系所不具有的大小为110kDa的蛋白。采用亲和层析的方法分离纯化了棉铃虫中肠Cry1Ac受体蛋白,得到一条大小约为175kDa的蛋白条带。 利用125Ⅰ标记三种Cry1A(Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac)蛋白,分别与Cry1Ac抗、感品系棉铃虫中肠BBMV进行了体外标记结合试验。同源竞争结果显示:两个品系的BBMV与Cry1Ac的亲和性没有显著差异,但抗性品系的结合位点浓度明显下降;异源竞争结合试验表明:敏感品系棉铃虫中肠BBMV存在三个Cry1A受体位点,受体1与三类Cry1A蛋白均发生结合,受体2与Cry1Ab和Cry1Ac发生结合,而受体3仅与Cry1Ac发生结合。棉铃虫对Cry1Ac产生抗性后,受体1仍然与三类Cry1A蛋白发生结合,但是与Cry1Ab的结合能力变弱,受体2与Cry1Ab发生结合,但不再与Cry1Ac发生结合。Western杂交证实:敏感品系棉铃虫中BBMV存在三个Cry1Ac的受体,其大小分别为110、120和175kDa;而Cry1Ac抗性棉铃虫只存在两个Cry1Ac的受体,即缺失了一条110kDa的蛋白,并据此构建了棉铃虫Cry1Ac抗、感品系的结合模型。上述研究表明棉铃虫中肠BBMV与Cry1A结合的受体位点分别位于不同的蛋白上,其中一个受体结合位点的缺失是棉铃虫对Cry1Ac产生抗性的主要原因。
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