苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)自从被发现至今已被广泛的应用于农业生产、森林保护、园林防治以及卫生害虫的防治。目前,越来越多的Bt制剂和Bt作物得到了广泛的开发和应用,在防治害虫方面取得了良好的防治效果。自20世纪20年代以来,Bt蛋白就已经用于农业害虫的防治,并取得了上佳的效果。因此,分离筛选高效、广谱杀虫活性的Bt菌株,克隆新的杀虫活性基因,为生产实践防病治虫提供新的资源。本研究通过广泛采取收集贵州地区土壤腐殖质,以此分离筛选了一批Bt菌株,并对其进行基因型鉴定、杀虫活性分析,得到一批鳞翅目害虫具有杀虫活性的Bt菌株,并从CS137-2和CS72-1两个菌株中克隆得到3个新的Bt基因。对贵州多个地区共收集1170份样品进行芽胞杆菌抗生素分离处理,总共获得976株芽胞杆菌,鉴定出181株Bt菌,平均分离率超过了18%。对得到这的一百多株Bt菌进行基因型分析,发现其中含cry1、cry2、cry4、cry8、cry9、cry20、cry22、cry28、cry30、cry31、cry37、cry40、cry46、cry52和cyt2共计15种基因型,有87株未鉴定出基因型。菌株中有31种不同的基因型组合,杀鳞翅目害虫的基因型组合菌株最多,此外,杀同翅目/鳞翅目和杀鞘翅目/双翅目的基因型组合菌株也均有发现。多数Bt菌株的表达蛋白在SDS-PAGE分析下呈多条带,以标准蛋白Marker为参照可知其主要表达30-130KDa大小的蛋白;显微镜观察也发现多种晶体类型,且多数同一菌株中包含两种晶体形态。Bt菌所产生的伴胞晶体形状有球形、大小菱形、方形、米粒形等。生物测定结果表明,其中有101株Bt菌对棉铃虫具有活性,另外有80株菌对棉铃虫无杀虫活性。表明,该地区的Bt资源丰富,基因类型丰富多样,杀虫谱广,具有良好的多样性。本研究从菌株中选择了基因类型丰富,杀虫活性高的菌株CS72-2和CS137-2作进一步研究。研究通过对CS72-2和CS137-2菌株进行全基因组测序并组装,根据测序组装结果设计引物对两个菌株进行PCR-RLFP克隆和PCR直接克隆,共克隆得到3个新基因,其中包含1个第二等级基因、1个第三等级基因和1个第四等级基因。分别命名为cry28-like、cry37-like、cyt2-like。将基因cry28-like构建穿梭表达载体pSTK后转入无晶体突变株HD73~-能产生菱形晶体。其对亚洲玉米螟和棉铃虫有杀虫活性,但对秀丽隐杆线虫和番茄根结线虫的无杀虫效果。对基因cry37-like和cyt2-like两个杀虫基因进行功能验证,生物活性测定表明两类诱导表达蛋白对两种鳞翅目昆虫具有杀虫活性,cry37-like和cyt2-like诱导表达蛋白对亚洲玉米螟和棉铃虫具有杀虫活性。cry37-like的诱导表达蛋白对秀丽隐杆线虫的杀虫活性相对较低,而对番茄根结线虫不具有杀虫活性。cyt2-like的诱导表达蛋白对秀丽隐杆线虫和番茄根结线虫的杀虫效果均较弱,72h后校正死亡率分别为35%和与30%。