论文部分内容阅读
7-脱氢胆甾醇不仅是重要的甾体激素中间体，还是合成维生素D3的关键前体，更可以作为制备胆甾相液晶的原料，具有明显的药用效果和广阔的市场前景。传统的7-脱氢胆甾醇制备方法主要是化学合成法，但由于化学法工艺流程长，反应步骤多，收率低，副产物去除过程复杂，能耗高且易对环境造成严重污染，极大限制了7-脱氢胆甾醇的生产和应用。虽然也有关于酶促生化反应生产7-脱氢胆甾醇的相关报道，但成本问题始终制约了该技术的工业化应用。利用生物技术合成7-脱氢胆甾醇可以解决以上的困难，国外已有课题组实现7-脱氢胆甾醇的生物全合成，但利用合成生物技术构建7-脱氢胆甾醇人工合成细胞，并对7-脱氢胆甾醇合成功能模块与底盘细胞的适配关系进行研究，目前还没有相关的报道。本研究利用合成生物学技术，从7-脱氢胆甾醇合成功能模块的构建和改造、酵母底盘细胞的优化两方面，注重挖掘功能模块与底盘细胞间的适配关系，降低酵母底盘细胞的代谢压力，提高与功能模块的适配性，从而增加7-脱氢胆甾醇产量。本课题主要包括三部分工作：过表达酵母固醇合成途径中的内源基因tHMGR、ERG1，敲除非必需基因ERG6、ERG5以抑制酵母固醇向麦角固醇的转化，通过对模块内不同强度启动子的考察，得到优选的改造后酵母底盘SyBE000956；引入人体来源的固醇C-24还原酶，同时过表达内源基因ERG3、ERG2，得到9个7-脱氢胆甾醇合成功能模块；将构建的功能模块导入底盘细胞，得到36株7-脱氢胆甾醇人工合成细胞，通过对不同强度启动子、改造后的不同底盘细胞等指标的考察，研究外源功能模块与底盘细胞间的适配机制。结果发现：底盘细胞相同的情况下，不同强度的启动子与底盘细胞的适配性由好到差依次为TDH3p、PGK1p、TDH1p；只包括单个基因元件DHCR24的功能模块构成的人工细胞7-脱氢胆甾醇的产量高于大部分包括基因元件ERG3、ERG2、DHCR24的功能模块所构成的人工细胞；外源功能模块相同的情况下，以优化后的SyBE000956为底盘的人工合成细胞，7-脱氢胆甾醇含量最高，与功能模块的适配性最佳。本课题为后续的7-脱氢胆甾醇人工合成细胞构建及适配机制的研究提供了理性设计的依据。