东北林蛙抗菌肽Dybowskin-2CDYa(GenBank收录号:EU827809)是本实验室前期工作中,从东北林蛙(Rana dybowskii)蛙皮中分离鉴定得到的一种新型抗菌肽,Dybowskin-2CDYa包含有18个氨基酸残基,富含精氨酸的阳离子抗菌肽。其氨基酸序列为SAVGRHGRRFGLRKHRKH,相对分子量为2154.2道尔顿,等电点pI为12.60,带有十个正电荷,在膜脂模拟环境中表现为a-螺旋的二级结构。实验室前期工作结果显示抗菌肽Dybowskin-2CDYa具有低溶血活性、高抑菌及广谱抗菌活性等生物活性特点。上述结果说明Dybowskin-2CDYa具有开发成新型抗生素的潜能,但其结构稳定性及抗菌机制并不清楚。本研究在前期研究的基础上,对Dybowskin-2CDYa的结构稳定性及抗菌机制进行了初步研究,以期对其抗菌过程进行合理的解释,为Dybowskin-2CDYa的应用提供理论依据。1.使用分子动力学(MD)模拟的研究方法,对抗菌肽Dybowskin-2CDYa预测得到的二级结构的稳定性进行模拟研究,结果表明抗菌肽Dybowskin-2CDYa能够在水溶液中保持稳定的a-螺旋二级结构,为后续实验中结构与抑菌过程中的行为研究奠定基础。2.利用透射和扫描电子显微镜技术分析抗菌肽Dybowskin-2CDYa与金黄色葡萄球菌菌细胞表面的相互作用,结果显示抗菌肽能够使细菌表面产生突起和孔道,使细胞通透性增加,破坏渗透压稳定,细胞内部物质外漏,引起细菌的死亡。3.利用荧光显微镜及CLSM技术进一步分析抗菌肽Dybowskin-2CDYa作用机制,荧光染料FITC只能在细菌细胞膜遭到破坏的情况下进入菌体内部,CTC能够与细菌正常细胞膜结合,DAPI与双链DNA结合。结果显示FITC荧光染料能够在抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌细胞时进入到细胞内部,表明抗菌肽在细胞膜上具有产生通道的作用,这也是引起细菌细胞渗透压发生变化的一个原因;CTC,DAPI荧光染料结果表明,与对照组相比,CTC标记的红色正常细胞数量减少,DAPI标记的染色体DNA正常的细菌数量减少但差异不显著,说明抗菌肽Dybowskin-2CDYa不能引起金黄色葡萄球菌菌体DNA的断裂。