目的1.从螃蟹甲药材中提取分离与富集总苯乙醇苷,并对总苯乙醇苷作定性及定量分析。2.对螃蟹甲药材的不同提取部位进行保肝药效学实验研究,通过观察螃蟹甲不同提取部位的药液对CCl4诱导肝损伤大鼠转氨酶(AST,ALT)水平的影响,筛选出螃蟹甲药材产生保肝活性的主要有效成分。3.研究螃蟹甲总苯乙醇苷在四氯化碳诱导的肝损伤大鼠体内是否能够发挥保肝作用及其作用机理。方法1.运用D101型大孔吸附树脂,从螃蟹甲药材中提取与富集苯乙醇苷类化合物,选用UV光谱法对其进行定性及定量分析。2.将已经饲养一周的Wistar大鼠70只,雌性,随机分为螃蟹甲25%乙醇洗脱物组、螃蟹甲50%乙醇洗脱物组(200 mL.kg-1)、螃蟹甲水洗脱部位(200 mg.kg-1)、螃蟹甲水提物(200 mL.kg-1)、阳性对照(联苯双酯)200 mL.kg-1及正常对照组(给予生理盐水),连续灌胃给药7 d,第6天正常组腹腔注射橄榄油,其余组腹腔注射15%CCl4橄榄油溶液0.25 mL/200 g(1.25 mL.kg-1)。第6天染毒后2 h及22 h各灌胃一次,观察大鼠的身体状态,末次灌胃1 h后眼眶静脉丛采血0.5 mL于离心管,静置30min,4500 r·min-1离心10 min,分离血清,稀释,生化检测仪检测各组大鼠的肝功能指标(AST、ALT)。3.60只Wistar大鼠,雌鼠,随机分为正常组,模型组,联苯双酯组(联苯双酯滴丸100 mL.kg-1),螃蟹甲大孔吸附树脂50%乙醇洗脱物高,中,低剂量组(400,200,50 mL.kg-1),连续灌胃给药4 d,正常组和模型组均给予纯化水,第3天给药1 h后,腹腔注射15%CCl4橄榄油0.25 mL/200 g,正常组腹腔注射橄榄油0.25mL/200 g,染毒2,22 h后再次给药,末次给药1 h后,眼眶静脉丛采血,生化检测仪测血清中ALT,AST,MDA,SOD水平,处死大鼠剖取肝脏,测肝指数及肝组织匀浆液中MDA,SOD,谷胱甘肽还原酶(GSH)含量,做肝脏组织病理学检查。结果1.根据课题组前期对螃蟹甲化学成分研究基础,进一步优化d101型大孔吸附树脂从螃蟹甲水提取物中分离富集各类成分。200-400nm波长紫外扫描,结果表明大孔树脂50%乙醇洗脱物(epy-50)与毛蕊花糖苷(acteoside)具有相似紫外扫描图谱,都在波长为330nm处有相似的吸收峰,且结合课题组前期采用hplc色谱法从螃蟹甲药材中分离并鉴定出3个苯乙醇苷类化合物,进一步推断螃蟹甲药材中大孔树脂50%乙醇洗脱物(epy-50)的主要成分是苯乙醇苷类。经d101大孔吸附树脂富集后的螃蟹甲药材中总苯乙醇苷含量由水提取物中的1.6%提高到21.6%,含量提高了13.5倍。2.螃蟹甲活性筛选实验表明,与模型组和其他组比较,螃蟹甲总苯乙醇苷能明显降低ccl4中毒引起的化学性肝损伤大鼠血清中ast和alt的水平(p<0.05或p<0.01)。3.螃蟹甲总苯乙醇苷保肝机制探究结果表明,相对于正常组,模型组大鼠血清中ast,alt水平显著增加(p<0.01),肝组织匀浆液中mda含量明显升高(p<0.05),sod,gsh含量明显降低(p<0.05),肝脏指数显著增加(p<0.01),显示造模方法较好。与模型组比较,螃蟹甲苯乙醇苷高,中剂量组能显著降低肝损伤大鼠血清中ast,alt水平(p<0.05,p<0.01),并显著减少肝组织中mda含量,提高sod,gsh含量,降低肝指数,改善肝组织病理状态。结论1.d101大孔树脂能够成功实现螃蟹甲中总苯乙醇苷的富集。2.本实验选用ccl4诱导急性肝损伤模型,从实验结果可以得出此种模型可以现在引起实验动物血清中ast、alt水平和肝脏组织匀浆液中mda升高、sod、gsh含量降低、肝脏组织结构产生病变,是重复性较好的造模方法。以总苯乙醇苷为主要成分的螃蟹甲药材50%乙醇洗脱物是螃蟹甲具有保肝作用的活性成分。螃蟹甲螃蟹甲总苯乙醇苷能够显著降低四氯化碳中毒大鼠血清中的ast,alt(p<0.01),是其产生保肝作用的主要活性部位。3.螃蟹甲总苯乙醇苷针对ccl4诱导大鼠急性肝损伤的病理状态产生了保护作用,其机制可能与苯乙醇苷类独特的生物活性相关,抗氧化作用、清除氧自由基、抑制脂质过氧化产物MDA的生成,并相对恢复SOD和GSH水平,使得过氧化与抗氧化体系恢复平衡状态,降低转氨酶水平等可能是其产生护肝作用的关键。本研究结果为从螃蟹甲及其他含苯乙醇苷类成分的药用植物中挖掘出具有保肝活性的天然药物提供了研究基础和思路。