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肉质性状是重要的经济性状。但由于其表型测定需要屠宰,对其遗传机制的解析非常有限,目前只有少数几个肉质主效基因被鉴别。肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)含量与肉的风味和食用价值紧密相关。肌内脂肪含量越高,肉的嫩度、多汁性和总体可接受度等也越高。因此,研究猪高肌内脂肪含量形成的遗传机制,不仅具有理论意义,更具有重大的商业价值。本项目首先对覆盖莱芜猪所有父系血缘及大部分母系血缘的316头纯种个体进行屠宰测定并系统检测其18个肉品质性状,利用猪60K SNP芯片对316头纯种莱芜猪个体的肉质性状开展全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)。结果共检测到170个染色体显著水平的SNP,其中112个达到了基因组显著水平,58个达到了染色体显著水平。这些显著SNP位点主要分布在SSC1、4、12和15上。其中25个SNP与肌内脂肪含量的关联性达到基因组显著水平,除11号染色体上的ss131037242,其余达到基因组显著水平的SNPs在12号染色体上57.83～60.80 Mb的一个大约2.97 Mb的区域内,其中最强关联SNP位于57.83 Mb处(ss131468514,P=2.09×10-13),该SNP可解释29.3%的表型变异。通过LDLA分析进行精细定位,最显著位点在58.42 Mb处(P=2.51×10-36);采用LOD值下降2确定的置信区间为58.04～59.65 Mb约1.60 Mb区域。之后在该区域增加了127个SNP进行精细定位,结果表明与IMF关联最强SNP为rs49,位于58.36Mb处(P=4.81×10-15),该位点解释的表型变异为34.7%。根据最强关联SNP位点LOD下降2和r2≥0.8确定的QTL置信区间为525.99 Kb。我们构建区域内单倍型,并通过单倍型共享分析将QTL区间缩小至128.15 Kb。对525.99 Kb的QTL区间开展深度重测序,获得了 131与QTL基因型一致的SNP。对获得的SNP进行基因分型和关联分析,结果发现与背最长肌IMF最强相关的SNP是MYH4基因内的一个错义突变(rs222),其P值为2.86×10-16,该位点解释表型变异为39.4%。而且rs222还显著影响肉色、大理石纹、水分和眼肌面积,但对背膘厚度等性状基本没有影响。在上述525.99 Kb QTL区域内包含了9个功能基因,其中3个基因在300日龄背最长肌中无表达。对剩余6个基因表达量与肌内脂肪含量进行QTT分析,发现仅有MYH4基因的表达量与肌内脂肪含量极显著相关,其相关系数r值为-0.39,P值为3.53× 10-6。6个基因eQTL定位结果也表明,仅MYH4定位到显著的eQTL。而且与MYH4表达量关联最强SNP与上述所得到的与IMF关联最强SNP 一致,均为rs222。通过QTT及eQTL分析均显示MYH4基因和rs222是影响肌内脂肪含量的因果基因及因果突变位点。为了进一步验证rs222是SSC12上肌内脂肪含量的因果突变,本研究采集了 419头鲁莱猪、77头杜洛克×玉山黑猪和821头嵌合家系F6群体,关联分析结果均表明rs222为最强相关位点。此外,本研究制备了MYH4基因rs222单点编辑小鼠,基因编辑小鼠重复了莱芜猪的肌内脂肪表型和基因表达的变化,证实MYH4是因果基因,rs222是因果突变位点。为了进一步探究rs222是如何影响MYH4基因的表达,本研究开展了 DNApull down实验,发现rs222是一个蛋白结合位点,其突变导致了 90个差异结合蛋白。利用体外细胞共转染实验,证实了其中之一 ML6在野生型中和因果突变位点结合,提高MYH4表达,而在突变体中MYL6无法结合,不影响MYH4表达。本项目对rs222提高IMF的机理开展了进一步研究,我们在莱芜猪群体和基因编辑小鼠中发现,rs222突变会导致背最长肌中的ⅡB型肌纤维显著减少,而Ⅰ型、Ⅱx型和ⅡA型肌纤维显著增加,肌纤维组成改变导致GLUT4葡萄糖转运体通过AKT通路转位至细胞膜上并增加丰度,增加葡萄糖的摄取,从而导致肌内脂肪含量增加。综上所述,本研究在国际上首次发现了影响猪肌内脂肪含量的因果基因及因果突变位点,为高效选育优质雪花猪肉提供了理论基础及高效育种技术。