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背景：骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，约3/4的患者发病年龄在10～30岁，是青少年最常见的骨骼恶性肿瘤，有起病急、肺转移早、死亡率高的特点[1]。骨肉瘤临床治疗效果差，特别是转移或复发的病人，近50年来治疗并未取得的很大的进展，长期生存率不到25％[2]。因此，寻求骨肉瘤治疗的新方法已成为临床迫切所需。化疗是常见的骨肉瘤治疗方法。二十世纪七十年代，顺铂作为抗肿瘤药物在临床上的广泛使用，使金属配合物的抗肿瘤活性成为生物医药领域的研究热点之一。铂类抗肿瘤药也成为骨肉瘤化疗的四大经典药物之一[3]。然而铂类药物存在严重的不良反应（神经毒性，肾毒性等）和耐药性（天然性或诱导性）[4]。为了弥补这些不足，人们一直在其他金属化合物中寻找铂类的替代品。钌配合物以其抗癌细胞毒性、类似铂类化合物的配体交换能力、与顺铂无交叉耐药性以及通过铁转运机制对人体毒性低等特性引起了广泛的关注，目前普遍认为钌配合物将成为最有前途的抗癌药物之一[5-7]。欧盟自1997年成立了钌抗癌药物的研究和发展工作组，进一步加强钌抗癌药物的研究，某些钌金属配合物已经进入了一期临床[8,9]。但是钌配合物也存在对不同肿瘤细胞抑制效果不一以及缺乏靶向性等缺陷。近年来，有报道称新合成的[Ru（dmb）2（DBHIP）]（ClO4）2能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡，如BEL-7402，C-6，HepG-2和MCF-7[10]。辐射诱导细胞凋亡是目前肿瘤放射生物学研究的热点[11，12]。凋亡是细胞受照射后一些细胞死亡的重要方式，凋亡小体是目前判断细胞凋亡的重要形态指标[11]。辐射引起肿瘤细胞凋亡的生物学机制尚不清楚，有研究报道，许多癌基因和抑癌基因参与细胞凋亡的调控，其中包括Bcl-2和Bax. Bcl-2是凋亡研究中最受重视的癌基因之一。目前临床上对于晚期骨肉瘤及手术后的骨肉瘤治疗方面，往往采用化疗、放疗、生物治疗等多手段的联合治疗方案。本研究用不同浓度[Ru（dmb）2（DBHIP）]（ClO4）2联合不同剂量的X射线对骨肉瘤MG-63细胞进行不同的时间处理后，观察其对骨肉瘤细胞生长抑制、诱导凋亡情况，并观察钌（Ⅱ）多吡啶配合物对骨肉瘤MG-63细胞的放射治疗有无增敏作用，以求在骨肉瘤治疗方面有所新发现。目的：研究钌（Ⅱ）多吡啶配合物对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的诱导作用，以及对骨肉瘤MG-63细胞的放射有无增敏作用，并对其作用机制进行初步的研究。方法：一、钌（Ⅱ）多吡啶配合物对骨肉瘤MG-63细胞的凋亡诱导作用的实验研究1、在培养液体系中加入不同浓度的钌（Ⅱ）多吡啶配合物[Ru（dmb）2（DBHIP）]（ClO4）2对骨肉瘤MG-63细胞进行处理，以CCK-8计数法测细胞生长曲线，并采用浓度梯度法计算药物的LD50。2、细胞集落形成法观察细胞生长抑制情况，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况，Annexin V-FITC/PI双染色测细胞凋亡，Hoechst-33258染色观察细胞核的形态变化。二、不同剂量X射线照射处理对骨肉瘤细胞凋亡诱导作用的实验研究1、对培养液体系中骨肉瘤MG-63细胞进行不同放射剂量的放射处理后继续培养，不同时间段后以CCK-8计数法测细胞生长曲线。2、以细胞集落形成法观察细胞生长抑制情况，流式细胞仪检测细胞周期情况，Hoechst-33258染色观察细胞核的形态变化。三、钌（Ⅱ）多吡啶配合物联合放射处理对骨肉瘤MG-63细胞的凋亡诱导作用的实验研究1、对培养液体系中骨肉瘤MG-63细胞进行不同浓度的钌（Ⅱ）多吡啶配合物联合不同放射剂量的处理，继续培养不同时间段后以CCK-8计数法测细胞生长曲线。2、以细胞集落形成法观察细胞生长抑制情况，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况，Wester-blot法测细胞凋亡情况，Hoechst-33258染色观察细胞核的形态变化。四、统计学分析：数据以均数±标准差（x±s）表示。全部数据经统计软件SPSS17．0处理。采用重复测量设计的方差分析评价各组之间变化,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、本文第一部分研究结果显示，浓度梯度法测得药物的LD50为175.7μmol/L。钌（Ⅱ）多吡啶配合物能明显抑制骨肉瘤细胞生长，生长抑制率随着药物浓度的增大而增大。药物处理后细胞周期的各时相比例发生了变化，较对照组呈现出明显的G1期阻滞。流式细胞仪检测结果示药物能明显诱导MG-63细胞发生凋亡，并且呈浓度依赖效应，药物浓度越高，早期细胞凋亡越明显。Hoechst-33258染色结果显示，对照组细胞在荧光显微镜下观察细胞核完整，荧光成弥散状，比较黯淡，经钌（Ⅱ）多吡啶配合物处理的骨肉瘤细胞则染色质凝聚，细胞核裂解，荧光比较明亮，证实钌（Ⅱ）多吡啶配合物能引起MG-63细胞DNA降解、细胞核破裂，进而诱导人成骨肉瘤MG-63细胞走向凋亡。2、本文第二部分研究结果显示，经X射线照射后的骨肉瘤细胞表现出明显的生长抑制，并呈时间和剂量依赖关系。10GYX射线处理4天后，细胞生长抑制率达到55.44%。随着照射剂量的增加，细胞集落数明显减少。实验对照组、2GY、5GY、10GY处理细胞14天后，细胞集落数均数分别为：（52±3.57）、（56±3.53）、（41±2.35）、（13±1.24），细胞集落的贴壁率（%）分别为52%、28%、8.2%、1.3%。X射射线能够明显抑制骨肉瘤细胞的增殖，呈G2期阻滞，并呈现剂量依赖效应，照射剂量越高细胞处在G2期的比例越高，由对照组的（3.84±0.15）%增加到2GY组的（8.46±0.14）%，再增加到5GY组的（13.19±0.07）%，增加倍数分别为2.2、3.4倍。不同剂量放射处理组与对照组比较，差异均有显著性意义（均P<0.05）。Hoechst-33258染色结果显示未受处理组肿瘤细胞形态规则，染色质分布均匀，核完整，经X射线照射后，在一定范围内，随着剂量增大，细胞凋亡越来越多，且凋亡细胞的形态结构越发典型，表现为核固缩，染色质边集于核膜处，核小体形成等。3、本文第三部分研究结果显示：钌（Ⅱ）多吡啶配合物联合X射线组处理骨肉瘤细胞的生长较单独处理组明显受抑制，并随着浓度的增加和时间的延长，差异性逐渐变大，表现出明显的联合效应。细胞集落计数结果显示：随着药物浓度的增加和照射剂量的加大，细胞集落数明显减少，百分比呈现明显的降低趋势。用150μmol/L联合5GY处理组，细胞集落的形成的百分比为0.8%，与对照组56%相比，两个相差近70倍。流式细胞术检测细胞凋亡结果示：联合组细胞凋亡率为：（61.2±3.98），是试验对照组的（0.2±0.02）的306倍。Hoechst-33258染色结果显示，联合组与单独组、对照组能更好的引起MG-63细胞DNA降解、细胞核破裂，诱导细胞走向凋亡，二者联合有相互促进细胞发生凋亡的作用。Western Blot检测抗凋亡基因Bcl-2结果显示联合组Bcl-2表达最低，试验对照组表达最强，并随着药物浓度及照射剂量的加大表达越低，提示钌（Ⅱ）多吡啶配合物联合X射线杀伤骨肉瘤细胞的作用可能是通过降低Bcl-2的表达而诱导MG-63细胞发生凋亡实现的。结论：1、浓度梯度法测得钌（Ⅱ）多吡啶配合物的LD50为175.7μmol/L。钌（Ⅱ）多吡啶配合物使骨肉瘤细胞周期处于G1期阻滞，并能诱导骨肉瘤细胞发生凋亡，随药物浓度增大，诱导凋亡作用越强。2、X射线抑制骨肉瘤MG-63细胞生长，呈现出剂量依赖性。照射处理后的骨肉瘤细胞表现出明显的G2期阻滞。在一定范围照射范围内，随着照射剂量增大，细胞凋亡越明显，细胞的显微结构表现为核固缩，染色质边集于核膜处，核小体形成等。3、钌（Ⅱ）多吡啶配合物[Ru（dmb）2（DBHIP）]（ClO4）2联合玛射射线可促进骨肉瘤MG-63发生凋亡，表现出明显的联合效应，诱导细胞发生凋亡的机制可能与降低Bcl-2的表达有关。4、本实验为钌（Ⅱ）多吡啶配合物能够诱导骨肉瘤细胞发生凋亡提供了实验室基础，同时也表明钌（Ⅱ）多吡啶配合物对骨肉瘤细胞有放射敏感作用，为以后相关领域的研究奠定了实验室基础。