论文部分内容阅读
一、研究目的骨髓间充质干细胞(MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,在不同诱导条件下,具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞及骨髓基质等组织细胞分化的潜能。由于MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便、体内免疫反应较弱等特点,在临床上有广泛的应用前景。但是MSCs在骨髓中的含量极少,长期培养易衰老,因此寻找安全有效的促进MSCs增殖的方法已是当前的迫切问题。中医根据“肾为先天之本”的理论,采取补肾中药促进MSCs的增殖,取得了一定的效果。龟板入肝肾经,具有滋补肝肾,益肾填精之效。研究表明龟板含药血清在不同时间可以促进MSCs的增殖和分化,这种作用和BMP4激活不同的受体有关,DNA结合抑制蛋白1(Id1)是BMP4的直接靶基因,其表达直接受BM4P调节而不需要重新合成其他蛋白质。同时,Id1是细胞增殖和分化的关键调控蛋白,Id1的表达增强,促进细胞增殖,抑制细胞分化;反之,则抑制细胞增殖,促进细胞分化。因此,可以借助Id1探讨龟板提取物促进MSCs增殖和分化的活性成分及其分子机制。在龟板提取物作用于MSCs的过程中,核受体可能是其作用的药理靶点。RAR的表达增强可以促进MSCs的增殖,而VDR的表达增强则促进了细胞的分化。二、试验方法和内容本实验以大鼠的基因组DNA为模板克隆了长度为1742bp(-1765/+88)的大鼠的Id1启动子序列,将其连接到带有luciferase报告基因的PGL3-basic载体上,测序正确后,用磷酸钙共沉淀法转染MSCs,将龟板提取物(PTE)及其九个标准品(S1-9)、视黄酸(RA)、视黄酸受体阻断剂(Ro41)、维生素D(VD)溶于二甲基亚砜(DMSO)中,加入低、中、高剂量的龟板提取物及合适剂量的其它药物培养不同时间,检测Luciferase表达量,Luciferase合成量反映Id1启动子活性的状态。骨髓中存在多种类型的细胞,骨髓间充质干细胞(MSCs)是其中之一。试验中所提取的MSCs纯度如何,是否可以研究使用?本实验选取Ⅲ代MSCs,荧光标记MSCs特异性表达CD44,流式细胞仪检测MSCs的纯度。BMP信号通路参与了龟板提取物促进MSCs分化,生长因子BMP4可以促进MSCs的成骨分化,所以BMP4在龟板提取物作用于MSCs过程中的作用也是我们希望研究的一个方面。本实验采用磷酸钙共转染的方法,共转染Id1和BMP4,形成BMP4过表达的状态,一方面,通过检测Luciferase表达量,观察Id1启动子活性的变化;另一方面,提取MSCs细胞总RNA,逆转录cDNA,以cDNA为模板,检测在此过程中一些蛋白转录水平的变化。同时,运用RT-PCR的方法,检测龟板提取物作用于MSCs的过程中,Id1、RAR、VDR等蛋白转录水平的变化。实验首先提取龟板提取物及其活性成分作用不同时间点的MSCs总RNA,逆转录cDNA,以cDNA为模版,检测在此过程中一些蛋白转录水平的变化,从而观察龟板提取物作用于MSCs的活性成分。同时,将视黄酸(RA)、视黄酸受体阻断剂(Ro41)、维生素D(VD)和龟板提取物联合应用,作用于MSCs,一定时间点后,提取MSCs总RNA,逆转录cDNA,以cDNA为模板,检测一些蛋白转录水平的变化,从而观察龟板提取物作用于MSCs的药理靶点。三、实验结果流式细胞仪检测MSCs纯度发现,所培养的MSCs纯度达90%以上。测转染质粒后Id1启动子的luciferase和pRL的酶活性,结果表明PGL3-basic组luciferase表达量低于PGL3-Id1组,约为PGL3-Id1组的1/4;龟板提取物(PTE)可以提高Id1启动子luciferase表达量,早期PTE的作用随时间和剂量的增加而增强,其中促MSCs增殖的活性成分是十八酸乙酯(S6)、十四酸甾醇酯(S8)、4-甾酮(S9),他们之间有一定的协同作用;共转BMP4时,Id1启动子的活性降低;RA和PTE共用可以提高Id1启动子的luciferase表达量,Ro41和PTE共用则抑制了这种表达,单独应用时则没有此种效果。RT-PCR结果显示,不同剂量PTE作用于MSCs,早期(36小时和3天)促进了Id1转录水平的表达,这种促进作用有一定的剂量依赖性,与此同时,RAR的表达增强,VDR的表达降低;晚期(7天)则抑制了1d1转录水平的表达,此时,RAR的表达降低,VDR的表达增强。共转染BMP4时,BMP4呈现高表达状态,Id1和RAR的转录活性均降低。RA、Ro41共用PTE时,影响了核受体RAR的表达,RA共用PTE促进了RAR的表达,Ro41共用PTE抑制了RAR的表达,RAR表达增强促进了Id1的表达,其减弱时抑制了Id1的表达。四、结论构建的Id1启动子具有转录活性。龟板提取物作用于MSCs早期剂量依赖性的促进了Id1的表达,从而促进了MSCs的增殖,其促进MSCs增殖的活性成分是十八酸乙酯(S6)、十四酸甾醇酯(S8)、4-甾酮(S9),他们之间有一定的协同作用;龟板提取物作用于MSCs7天时降低了Id1的表达,可能促进了MSCs的分化。BMP信号通路参与了PTE对MSCs增殖和分化作用的调控,高表达BMP4降低了Id1的表达,促进了MSCs的分化。在PTE作用于MSCs的过程中,RAR和VDR是PTE作用于MSCs的药理靶点。其中,RAR的表达和MSCs的增殖有关,VDR的表达和MSCs的分化有关。