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J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是反转录病毒科α肿瘤病毒属的禽白血病病毒/禽肉瘤病病毒群中的一个亚群,由英国学者Payne于1991年在肉鸡上发现。该病毒主要引起鸡的髓细胞瘤白血病,给世界上许多国家的养鸡业带来了巨大的经济损失。ALV-J既可水平传播,又可垂直传播。目前,种群净化是防控J亚群禽白血病的有效措施,因此有必要建立起准确、快速、灵敏的ALV-J检测技术。本研究采用PCR方法克隆出本室分离保存的JS-9-09-Ch株ALV完整的gp85基因,并进行测序,上传序列获得GenBank登录号为：JF911743。分别克隆到pET-32a(+)和pGEX-6P-1载体,构建重组质粒pET-32a(+)-gp85和pGEX-6P-1-gp85。将重组质粒转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达gp85融合蛋白。表达的融合蛋白分别用High-Affinity Ni-IDA Resin和High-Affinity GST Resin纯化。以His-gp85融合蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫SPF鸡,每隔两周进行加强免疫,制备抗gp85的阳性血清。以GST-gp85包被酶标板、抗gp85阳性血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为二抗,建立起检测ALV-J gp85抗体的间接ELISA方法。经过对反应条件进行优化,确定GST-gp85最佳包被浓度为0.05μg/孔,阳性血清的稀释倍数为1：500,血清作用时间为60min。将纯化的GST-gp85融合蛋白用等量的弗氏完全佐剂乳化,皮下多点免疫6周龄BALB/c小鼠,免疫剂量为200μg/只；每隔两周以相同的方法以弗氏不完全佐剂与抗原乳化后加强免疫,免疫剂量为100μg/只；第四次免疫后两周,以GST-gp85融合蛋白按100μg/只的剂量加强免疫,4d后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。用纯化的His-gp85包被ELISA反应板,间接ELISA法筛选阳性克隆,并对阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆,获得6株稳定分泌抗gp85单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以5×105个/只的杂交瘤细胞数量腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,并对单抗进行相应生物学特性鉴定。Western-blot试验表明,研制的单抗针对ALV-J gp85蛋白。单抗间接免疫荧光试验对感染ALV-J的DF1细胞呈阳性反应,为ALV-J的检测提供了新方法。