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硝基酚类化合物是一类重要而且常用的化工原料,被广泛应用于合成医药、农药、炸药、染料、色素和橡胶等化工产品,同时也是一些有机磷杀虫剂如甲基对硫磷的中间代谢产物。由于硝基酚类化合物结构稳定,在环境中难以较快降解,它的广泛应用导致很多环境污染。微生物特异性降解具有成本低廉和环境友好的特点,可成为该类污染快速去除的主要方式。本实验室前期从化工废水中筛选得到的一株对硝基酚(PNP)降解菌Methylobacterium sp.C1,并对其生长和PNP代谢产物进行了研究。本研究利用第二代测序技术(Illumina Miseq测序平台)和第三代测序技术(PacBio RS Ⅱ测序平台)相结合的方式对C1菌的全基因组序列进行了测定,获得了菌株的全基因组序列(NZ_CP 017640)。利用 KEGG、eggNOG、Swiss-Prot、GO等数据库对开放阅读框进行基因注释,检索注释结果发现单加氧酶(NPM)和双加氧酶(HQD)。通过蛋白进化树分析确认NPM和HQD分别为PNP代谢途径中关键的对硝基酚单加氧酶和偏苯三酚1,2-双加氧酶。将单双加氧酶基因上下游开放阅读框与已知PNP降解菌相关酶的蛋白进行序列比对,在全基因序列中找到一段约27 000 bp的序列可能为C1菌PNP代谢基因簇。为了使单双加氧酶基因可以在其他菌种中组成型表达,并且能直观的观测到质粒及细胞的分布和活动,对双表达质粒pCDFDuet-1进行了改造。构建了可组成型表达绿荧光蛋白的双表达载体pCDF-GFP。在此基础上将单双加氧酶基因整合至pCDF-GFP载体上,获得重组表达载体pCDF-HQNP。另外通过基因合成和酶切连接,将pCDF-GFP载体中lac operator和相关标签序列去除,最终获得带有绿荧光蛋白示踪的且进行组成型表达单双加氧酶的重组质粒pCDF-HQNP+。由于很多自然菌株不能在实验室培养,而传统的细胞转化方法难以在环境中直接实施。因此利用超声波转化法可原位转化的特点,在LB培养液中直接对E.coli BL21(DE3)进行质粒转化,为后续将单双加氧酶基因导入自然成膜菌中进行初步探究。实验中成功将质粒pCDF-GFP转入细胞内。通过菌液浓度、处理时间、质粒浓度和金属离子的探究,得到不同条件下的最适的转化条件。且在OD600=1,50 mM CaC12和质粒1 ng/μL的条件下,超声处理60 s,得到的最佳转化率为(1.20±0.06)×106CFU/ng。