苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒odv--e18的功能研究

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杆状病毒的宿主范围主要是昆虫鳞翅目,双翅目及膜翅目昆虫也有报道。杆状病毒基因组是双链DNA (dsDNA),其中最小的基因组约80kbp,最大的约180kbp。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)的基因组大小为134kbp,包含150个开放阅读框(open reading frame, ORFs)。odv-e18(e18, ac143)是AcMNPV的第143号ORF。其同源基因存在于所有已完成测序的杆状病毒基因组中。本文以e18为对象进行了研究,主要的研究结果有以下的几个方面:通过X-Red同源重组技术敲除AcMNPV基因组中的e18,用氯霉素乙酰转移酶基因替换e18开放阅读框中1-63bp的序列,最终构建成e18敲除型突变体vAce18KO。1.利用Bac-to-bac表达系统将带有绿色荧光蛋白基因gfp及多角体蛋白基因polh的载体转座到e18敲除型突变体vAce18KO及野生型Bacmid中,最终构建成两种突变体:VAce18KO-gfp-PH、vAcgfp-PH。与此同时构建了具有两种标记基因的异位回复突变体vAce18KO-rep-gfp-PH。将构建好的重组病毒转染Sf9细胞,并用转染后120h的病毒上清液进行感染实验,发现缺失e18的重组病毒虽然不影响包涵体的形成,但不能产生具有感染性的BV,说明e18对于病毒增殖是必需的。2.用AcMNPV早期基因iel的启动子控制e18基因,构建两种突变体vAcPiel-e18-gfp-PH和vAcwt-Piel-e18-gfp-PH。vAcPiel-e18-gfp-PH缺失了原有的e18并在polh位点另外插入一拷贝在iel启动子控制下的e18。vAcwt-Piel-e18-gfp-PH同时含有正常e18和在polh位点另外插入的一拷贝在iel启动子控制下的e18。用这两种突变体进行转染-感染实验,发现vAcPiel-e18-gfp-PH在被转染的细胞中能产生包涵体,但不能产生具有感染性的BV;而vAcwt-Piel-e18-gfp-PH能正常产生包涵体和有感染性的BV。3.用AcMNPV极晚期超表达基因p10的启动子控制e18基因,构建异位回复突变体vAce18KO-rep-Pp10-e18-PH。其原有的e18基因被敲除而在polh位点异位插入一拷贝在p10启动子控制下的e18。用该突变体进行转染实验,发现产生多角体的细胞数目较少。4.用野生型病毒感染细胞,运用免疫荧光技术处理感染后0h、12h、18h、24h、48h及72h的细胞,通过共聚焦显微镜观察E18的亚细胞定位。病毒感染Sf9细胞后12hE18出现在细胞质中;感染后18h绝大部分的E18仍位于细胞质中,只有少量进入细胞核;感染后24hE18已全部进入细胞核中;感染后48h及72h,E18持续以环状形式存在于细胞核的环区(ring zone).
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