论文部分内容阅读
肿瘤多药耐药(Multidrug resistance, MDR)是临床上化疗失败的主要原因之一。迄今,许多抗肿瘤药物如紫杉烷类、长春碱类和蒽醌类等,在临床上都出现了多药耐药性。从药物传递系统的角度研究逆转肿瘤MDR是治疗多药耐药肿瘤的一种新思路。本文以Pluronic聚合物胶束和紫杉醇(PTX)作为研究对象,旨在制备一种新型紫杉醇给药系统,既能增溶疏水性的抗肿瘤药物紫杉醇,同时又具有逆转肿瘤MDR的能力,以解决紫杉醇临床应用的两大问题：水难溶性与耐药性,为探索逆转肿瘤多药耐药性的新途径提供实验依据和理论基础。本文的主要内容包括如下四个部分：(1)载紫杉醇Pluronic P123/F127混合胶束的制备与表征；(2)载紫杉醇Pluronic P123/F127混合胶束用于治疗肺多药耐药肿瘤和肺转移肿瘤的体内外评价；(3)Pluronic P123/F127逆转肿瘤多药耐药机制的探讨；(4)叶酸修饰的载紫杉醇Pluronic P123/F127混合胶束于治疗多药耐药肿瘤的体内外评价。首先,采用薄膜水化法制备了载紫杉醇(PTX) Pluronic P123/F127混合胶束(PF-PTX)。在单因素考察基础上,以包封率、载药量和胶束稳定性为指标,应用Doehlert矩阵设计(Doehlert Matrix Design, DMD)-渴求函数(Desirability Function)法进行优化,得到最优处方与制备工艺。按最优处方制备的PF-PTX经理化性质表征可得：PF-PTX的粒径约为25 nm；包封率大于90%；与Taxol相比释药速度显著减慢,具有一定的缓释作用；经1HNMR和FT-IR图谱验证PTX被成功包载于胶束的疏水核心；Pluronic P123/F127(2:1,w/w)的CMC值较低,为0.0059%；处方中Pluronic F127的引入显著增强了胶束体系的稳定性。其次,以肺耐药相关蛋白过度表达的A-549细胞为肺耐药细胞模型,进行了细胞毒、细胞摄取、细胞凋亡和细胞周期等细胞水平实验。结果表明PluronicP123/F127可与PTX协同作用,通过耗竭细胞内ATP和降低线粒体跨膜电势等途径增加PTX的摄取量,从而促进耐药细胞的晚期凋亡、增强PTX在G2/M期的捕获能力和细胞毒作用,故具有一定逆转肿瘤MDR的能力。荷瘤小鼠组织分布研究结果表明,对于肝和脾中PTX的蓄积量,PF-PTX组显著低于Taxol组(P<0.05)；而对于在血和肿瘤中PTX的分布,PF-PTX亦显著高于对照组(P<0.05),可见PF-PTX的PEO链可有效减少血浆蛋白的吸附以及肝、脾等MPS系统的吞噬。另外,在肺和肾脏中,PF-PTX的蓄积量显著高于Taxol组(P<0.01),提示PF-PTX可能是一种理想的治疗肺多药耐药肿瘤的药物传递系统；应用小鼠皮下肿瘤模型和肺转移肿瘤模型对PF-PTX进行了药效学评价,结果表明与Taxol组相比,PF-PTX组具有明显地控制肿瘤生长和转移的作用,显著延长荷瘤小鼠的生存期,且没有明显的毒副作用。第三,以耐阿霉素人乳腺癌细胞(NCI/ADR-RES)为细胞模型,以4种溶解性不同但均为P-gp的经典底物—罗丹明-123(R-123)、罗丹明-6G(R-6G)、盐酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)为P-gp分子探针,考察了不同浓度的Pluronic P123/F127(2：1,w/w)对4种探针在细胞内蓄积的影响,结果表明Pluronic P123/F127对疏水性或亲水性的P-gp底物均具有逆转活性,且当Pluronic P123/F127浓度大于CMC值时,其逆转能力与载体材料的浓度无关,分子探针被胶束增溶是导致分子探针在胞内蓄积量减少的主要原因。另外,实验表明耗竭耐药细胞内的ATP是PluronicP123/F127逆转MDR的重要机制；Pluronic P123/F127可作用于线粒体并显著降低线粒体的跨膜电势,故可能存在通过线粒体途径对凋亡信号进行调控等其它逆转机制；Pluronic P123/F127混合胶束通过网格蛋白和陷穴小泡两种内吞途径进入细胞。最后,成功制备了以叶酸为靶向头基的载紫杉醇(PTX) Pluronic P123/F127混合胶束(FPF-PTX),并对其进行理化性质的表征。以叶酸受体表达丰富的人口腔上皮癌细胞(KB)及耐长春新碱人口腔上皮癌细胞(KBv)为细胞模型,通过细胞毒、细胞凋亡、细胞周期、细胞共定位和内吞机制等一系列细胞水平实验表明,叶酸介导的主动靶向效应和Pluronic自身逆转肿瘤MDR的特性可协同增效,进一步增强FPF-PTX逆转肿瘤MDR的能力。另外,FPF-PTX通过网格蛋白和陷穴小泡两种途径入胞,具有浓度、温度和时间依赖性,并且游离叶酸的存在对叶酸受体具有竞争性结合作用；大鼠体内药动学结果表明,PF-PTX与FPF-PTX的长循环效果均显著优于Taxol组,其AUC0→t分别是Taxol组的2.96倍和2.67倍；体内平均滞留时间(MRT)分别是Taxol组的4.38倍和2.98倍；清除率(CL)相对于Taxol组均显著降低,即叶酸修饰的靶向胶束和普通胶束具有相似的动力学特征和长循环效应；药效学实验表明,FPF-PTX能显著抑制多药耐药肿瘤的生长,这进一步证实了FPF-PTX的主动靶向和逆转肿瘤MDR的双重效应。