背景和目的自组织工程学的概念提出以来,种子细胞、生物支架材料、培养环境就一直是重要的组成三要素,而其中种子细胞是实现组织修复与再生的前提和基础。干细胞以其自身独具的特性在诸多候选种子细胞中显示出了很大的优势。胚胎干细胞(embryonicstem cells, ESCs)虽然具有分化成所有类型细胞的潜能,但其存在异体移植伦理制约的问题,这也就使得成体干细胞(adultstem cells, ASCs)成为目前组织工程种子细胞的研究热点,并且已经在促进骨和软骨缺损修复已及颅面部组织再生方向取得了一定的成果。在成体干细胞中,乳牙牙髓干细胞(stem cells derived from human exfoliated deciduous teeeh, SHED)是近几年再生医学中又一极具应用潜力的种子细胞,SHED具有离成熟细胞近、可塑性强、免疫排斥小以及高度增殖能力和多向分化的潜能,并且在一定条件下SHED可向特定的细胞类型分化,产生数个亚系的前体细胞。除此之外目前研究还发现乳牙牙髓干细胞具有较强的诱导成骨能力,对骨缺损的修复具有十分重要的意义。我们的前期研究发现,将SHED与β-TCP复合培养后植入裸鼠体内可形成典型的软骨化骨的结构,说明移植材料在没有任何其他诱因的前提下,可在裸鼠体内自主发生软骨成骨。就目前报道来看,许多成体干细胞都具有向软骨细胞分化的潜能,有些成体干细胞已经运用于软骨组织的修复中,但未见SHED是否具有向软骨细胞分化能力的研究报道。而近些年SHED向成骨细胞分化的研究较多,但这些研究都是基于未特异性选择的基础上进行的。因此本课题第一部分旨在探索体外培养SHED在诱导体系的作用下,通过观察软骨细胞特异性标记物来确定SHED是否具有向软骨细胞分化的特性。实验第二部分,运用流式细胞仪选择带有特异性标记的SHED,分不同时间点观察分选后的细胞自行分化为成骨细胞的过程,目的为后续的SHED在体内参与软骨组织及骨组织修复提供一定的参考依据。第一章人乳牙牙髓干细胞体外定向诱导向软骨细胞分化的实验研究一、方法1 SHED的收集和培养依据Miura等的实验方法选取6～10岁健康儿童的滞留的乳牙,采用酶消化法培养细胞。将拔出的牙髓组织通过消化、过滤后得到细胞悬液,然后铺于细胞培养瓶内培养。2 SHED的观察和鉴定2.1细胞形态学观察观察原代和传代细胞生长、增殖情况以及形态特征,HE染色观察原代细胞组织学特征。2.2细胞表面抗原鉴定对原代细胞行细胞免疫化学染色分析,观察STRO-1的表达情况。2.3成脂分化诱导实验取原代细胞在成脂诱导液条件下培养,观察到脂滴形成后行油红-O染色。3 SHED体外诱导成软骨细胞3.1诱导后细胞形态学观察参照Johnstone B等实验方法对培养的第2代SHED进行诱导2周后,HE染色观察分化后的细胞的形态组织学特征。3.2甲苯胺蓝和番红-O染色对经诱导分化后的SHED细胞行甲苯胺蓝和番红-O染色观察分化后的细胞内外糖胺聚糖和蛋白多糖的表达情况。3.3Ⅱ型胶原及Aggrecan的表达情况对经诱导分化后的SHED细胞行免疫化学细胞染色和免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原及Aggrecan的表达情况3.4 RT-PCR检测Ⅱ型胶原基因表达运用RT-PCR方法检测定向诱导分化后的SHED细胞内Ⅱ型胶原在基因水平的表达情况。二、结果1 SHED的分离和培养原代培养的细胞一般在铺瓶3天后倒置显微镜下见贴壁细胞生长,形态呈现多形性。随着生长传代,细胞较多的出现梭形成纤维细胞样并且大小趋近一致。2 SHED的观察和鉴定2.1细胞HE染色观察原代细胞爬片HE染色：大部分细胞呈梭形,体积较小,轮廓清晰。细胞核为圆形或卵圆形,体积较大。少数细胞内可见多个核仁存在。2.2免疫细胞化学染色检测细胞表面抗原对原代培养的SHED行抗STRO-1免疫细胞化学染色,倒置显微镜下观察细胞呈阳性表达。2.3体外成脂诱导实验细胞在成脂诱导体系的的作用下,约15d可见个别细胞胞浆能出现高强度的折射点,20d左右亮点增多并有融合,油红-O染色呈阳性。3 SHED体外定向诱导成软骨细胞3.1诱导后细胞形态学观察诱导两周后细胞行HE染色：细胞形态由梭形变为软骨细胞典型的多边形形态,细胞体积较小,胞核深染。3.2甲苯胺蓝染色和番红-O染色对经向软骨细胞诱导分化后的SHED细胞行甲苯胺蓝和番红-O染色结果均为阳性。3.3检测成软骨细胞特性标记物免疫细胞化学染色观察Ⅱ型胶原呈阳性表达,免疫荧光染色观察可见Aggrecan有阳性表达。3.4 RT-PCR检测Ⅱ型胶原基因表达诱导2周后可见特异性的Ⅱ型胶原在300-400bp有表达。三、结论本实验成功对人乳牙牙髓干细胞进行原代培养,并在体外定向向软骨细胞诱导后,对细胞形态及软骨细胞的表型进行鉴定,证实人乳牙牙髓干细胞在体外具有分化为软骨细胞的潜能。第二章人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性的实验研究一、方法1 SHED的收集和培养同实验第一部分2流式细胞仪分选细胞当第2代乳牙牙髓干细胞细胞生长融合成单层后,消化制成单细胞悬液加入FITC-CD34和PE-CD117抗体,经流式细胞仪分选出两组细胞。A组：CD34+/ CD117+双阳性表达的细胞,B组：剩余的混杂细胞。3细胞形态学观察倒置显微镜观察分选后A、B两组细胞的生长形态,组织学HE染色观察。4免疫细胞化学染色检测SHED向成骨细胞分化分选后的细胞培养30d时,用免疫细胞化学染色法观察A、B两组细胞RUNX-2、OC、BSP的表达。5荧光定量PCR技术检测成骨细胞基因表达分选后的细胞培养40 d时,应用MX300p定量PCR仪进行荧光定量PCR实验,检测A、B两组细胞RUNX-2、OC、BSP mRNA的表达情况。6矿化结节形成能力的检测分选后的A、B两组细胞培养50 d时运用Von Kossa’s矿化结节染色法和茜素红染色法检测。二、结果1流式细胞仪检测细胞表面抗原及分选CD34+/CD117+的细胞为A组,占总细胞量的40.2%,剩余混杂细胞为B组,占总细胞量的58.5%。2细胞生长情况分选后的A、B两组细胞与分选前的细胞形态并无太大差别,都是呈长梭形,成集落状生长,HE染色观察见细胞为成纤维样细胞,细胞轮廓清楚,体积较小,胞核呈卵圆形或圆形,着色深,胞浆着色浅。3免疫细胞化学染色分选后A、B组的细胞分别制作细胞爬片,免疫细胞化学染色观察发现A、B组细胞均有成骨细胞标记物RUNX-2、OC、BSP的表达。4荧光定量PCR技术检测RUNX-2、OC、BSP mRNA的表达荧光定量PCR结果显示A、B两组细胞中均可检测到RUNX-2、OC、BSP mRNA表达,且A组的表达量均高于B组。5矿化能力的检测A、B两组细胞运用Von Kossa’s染色法和茜素红染色法检测,结果显示A组细胞呈阳性表达,B组细胞呈阴性表达。三、结论本实验证实经流式细胞仪分选可以获得初步纯化的CD34+／CD117+双阳性表达的SHED。纯化后的CD34+／CD117+双阳性表达的SHED具有体外自行向成骨细胞分化和形成矿化结节的特性。