目的青光眼视网膜，视神经的损伤是多因素，多基因综合作用的结果，其机制十分复杂。目前已经提出的各种假说中，有人提出缺氧学说。但目前并没有青光眼视网膜缺氧的直接证据。研究表明缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是与缺氧关系最密切转录因子，它作为缺氧应答的全局性调控因子激活缺氧反应性基因的表达，使机体产生一系列缺氧适应反应，维持氧稳态。因此对HIF-1及受其调控的目的基因与青光眼视网膜节细胞损伤的关系进行研究就有十分重要的意义。本课题拟从基因和蛋白水平研究正常视网膜组织，高眼压后视网膜组织中核转录因子HIF-1α，缺氧反应性基因iNOS，COX-2，Caspase-9基因和其相关蛋白的表达水平变化，以及视网膜节细胞形态和功能变化情况。探讨HIF-1、iNOS，COX-2，Caspase-9表达与高眼压视网膜节细胞的关系以及HIF-1和其调控低氧反应性基因在青光眼进展过程中的时空表达关系。从视网膜缺氧适应机制及缺氧反应性基因的调控角度进行研究，探讨青光眼视网膜氧适应基因调节失常，力图揭示青光眼视神经损伤的机制。并通过药物(EPO)抑制氧适应调控基因的过度表达，为青光眼视神经保护提供新的治疗思路。方法1慢性高眼压模型的制备电凝大鼠巩膜表面静脉阻断房水外引流途径制成模型；TONO-PENⅡ型笔式眼压计测量术前，术后30min，3d，7d，14d，21d，28d眼压。2光镜下视网膜形态学的观察：HE染色，并测量视网膜内界膜至外界膜距离即视网膜厚度。3电镜下视网膜形态学的观察4视网膜电图的测量：散瞳暗适应后角膜接触式电极法进行ERG-b波波幅检查。5正常视网膜，慢性高眼压视网膜，用药(EPO)后视网膜中HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9基因mRNA表达水平的初步研究应用RT-PCR法检测各组视网膜组织中HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9基因mRNA表达，统计结果均以均数±标准差表示，多组均数间的比较用OneWay-ANOVA分析，用药组与未用药组均数间的比较用配对t检验分析，均用SPSS12.0软件进行统计分析。6正常视网膜，慢性高眼压视网膜，用药后视网膜中HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9蛋白表达水平的初步研究应用非生物素二步法免疫组化及Western-Blot法检测正常视网膜，慢性高眼压视网膜，用药后视网膜中HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9蛋白表达的部位和程度。统计结果均以均数±标准差表示，多组均数间的比较用OneWay-ANOVA分析，用药组与未用药组均数问的比较用配对t检验分析，均用SPSS12.0软件进行统计分析。结果1电凝大鼠巩膜表面静脉阻断房水外引流途径制成模型，模型眼术后即刻眼压平均升高140％，术后3d时平均眼压是术前的1.77倍，术后7d时平均眼压是术前的2.66倍，术后14d平均眼压是术前的2.55倍：术后21d时平均眼压是术前的1.99倍；术后28d时平均眼压是术前的2倍。与造模前及对照眼比较差异有极显著性。高眼压后3d，ERG-b波波幅开始降低，14d达到最低后一直维持在低水平。2 RT-PCR法发现HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9 mRNA在正常视网膜中有低浓度的表达，高眼压3d后，表达明显上升，HIF-1α，iNOS，COX-2mRNA到7d时达到高峰，Casepase-9mRNA到14d时达到高峰；随后有所下降，但仍明显高于正常组的表达水平，差异有统计学意义；EPO组HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9 mRNA的增加趋势明显减弱，除iNOS，COX-2 mRNA在3d时差异不显著外在其余各个时间段与未用药组对比，具有显著性差异，有统计学意义。3免疫组化法发现HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9在正常对照的视网膜细胞的胞浆和胞核无阳性染色或极弱阳性染色；在实验组表现在细胞胞核和／或胞浆的不同程度的褐色或黄色阳性染色。HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9的免疫阳性染色主要位于视网膜内层即视网膜节细胞层和内颗粒层。另外HIF-1α，iNOS，Casepase-9阳性染色还见于视网膜的视椎，视杆层的内外节。Western Blot法发现HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9蛋白在正常视网膜中有低浓度的表达，高眼压3d后，表达明显上升，HIF-1α，iNOS，COX-2蛋白到7d时达到高峰，Casepase-9蛋白到14d时达到高峰；随后有所下降但仍明显高于正常组的表达水平，差异有统计学意义；EPO组HIF-1α，iNOS，COX-2，Casepase-9蛋白的增加趋势明显减弱，除iNOS，COX-2，Casepase-9蛋白在3d时差异不显著外在其余各个时间段与未用药组对比，具有显著性差异，有统计学意义。4未给药组高眼压后3d，7d视网膜厚度增厚，到21d，28d视网膜萎缩，变薄；EPO用药组7d，视网膜水肿明显减轻，21d，28d视网膜厚度变薄的趋势明显减弱，28d厚度恢复到正常的88％而未用药组28d是厚度只有正常的65％，具有显著性差异，用药组视网膜各层细胞排列较规整，未见明显的空泡化。用药组在高眼压7d时ERGb波明显恢复，在28d时未用药组ERGb波是正常的61％，而用药组恢复到80％，两者差异显著。结论1慢性高眼压后视网膜组织中HIF-1α的高表达为高眼压后视网膜存在缺氧提供了直接证据。2 HIF-1α与其下游靶基因iNOS，COX-2，Caspase-9的时空表达的密切相关性证实了青光眼早期的氧适应异常。而HIF-1的信号途径是青光眼神经变性的发生和进展中重要的病理生理机制。HIF-1作为“扳机点”调节着广泛的低氧诱导适应基因在细胞内的转录，并发挥他们蛋白质的不同生物学特征，最终决定了高眼压下视网膜中的对缺氧负荷反应的细胞的最终命运。3 EPO对慢性高眼压后损伤的视网膜有保护作用。4 EPO的保护机制是通过抑制HIF-1介导的低氧信号传导途径来完成的。通过对低氧适应性基因的调控来完成保护高眼压后视网膜的，也更说明HIF-1介导的低氧信号传导通路是青光眼视网膜损伤的主要病理机制。