弓形虫是一种机会性致病原虫，可引起人兽共患的弓形虫病。该病呈世界范围分布，孕妇感染弓形虫导致流产、胎儿发育迟缓、畸形或死胎。艾滋病、肿瘤患者等免疫力低下人群感染后可导致心肌炎、肺炎或致死性脑炎。弓形虫感染对畜牧业危害极为严重，家畜感染后生产性能大幅下降，造成重大经济损失。目前无较好药物和疫苗可在实际生产生活中应用，因此制备有效的疫苗和寻找药物治疗靶点成为当前研究热点。酪蛋白激酶（casein kinase，CK）是一类保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，可磷酸化机体多种重要蛋白。该激酶分为两大家族：一类为Ⅰ型酪蛋白激酶(casein kinase1，CK1)，一类为Ⅱ型酪蛋白激酶(casein kinase2，CK2)。CK1在脊椎动物体内已发现七种异构体，分别为CK1α，CK1β，CK1γ1，CK1γ2，CK1γ3，CK1δ和CK1ε，有的异构体还存在不同形式的剪接体。CK1在细胞分裂与凋亡、DNA修复、P53调控、周期性节律等机体多种生理活动中起着至关重要的作用。CK1α参与DNA修复、核转运、染色体分离及有丝分裂纺锤体形成等细胞生理活动的调节，在调节Wnt、Hedgehog、TNFα等信号通路中具有重要作用，同时该激酶还参与肿瘤的发生、发展。弓形虫作为一种重要的模式生物和人兽共患病原，CK1α功能还不清楚。为探索弓形虫CK1α功能，本研究克隆弓形虫CK1α cDNA，构建弓形虫CK1α原核表达载体，表达的重组蛋白免疫小鼠，制备弓形虫CK1α小鼠多克隆抗体，运用IFA方法检测CK1α蛋白在弓形虫体内表达部位；以腐草霉素抗性基因(ble)为筛选标记，构建弓形虫CK1α基因打靶载体，通过抗性筛选及相关鉴定，获得弓形虫CK1α缺失虫株；应用免疫荧光、流式细胞术及小鼠毒力试验等，确定弓形虫CK1α功能，为鉴定弓形虫病药物治疗靶点奠定基础。（1）弓形虫CK1α克隆及序列分析通过RT-PCR技术扩增CK1α编码序列，大小975bp。序列分析表明，弓形虫与其他寄生原虫CK1α高度同源，与新孢子虫同源性最高（98%），与隐孢子虫、艾美尔球虫同源性为92%，与巴贝斯虫、疟原虫同源性分别为82%和78%，与利什曼原虫、锥虫同源性最低（69%和68%）。哺乳动物间CK1α同源性高达90%以上，弓形虫与哺乳动物CK1α比同源性偏低，在58%-70%之间。进化树分析结果显示弓形虫与哺乳动物CK1α亲缘关系远，从序列水平分析CK1α具备作为弓形虫病药物治疗靶位点的条件。（2）弓形虫CK1α原核表达通过RT-PCR技术克隆弓形虫CK1α cDNA，构建原核表达载体pET-28a-TgCK1α，IPTG诱导重组蛋白表达，经SDS-PAGE和Western blotting分析，重组CK1α分子量为38kDa。经Ni-NTA纯化，重组CK1α浓度达3.1mg/mL，纯度达90%以上。将重组蛋白CK1α免疫小鼠，制备多克隆抗体，抗体ELISA效价达1:6400，运用IFA检测CK1α在弓形虫体内表达部位，结果证实CK1α主要在弓形虫细胞质中表达，靠近细胞核稍多。（3）弓形虫CK1α缺失株构建利用PCR方法克隆弓形虫CK1α侧翼序列，以ble为筛选标记，构建基因打靶载体，线性化后电穿孔转染弓形虫，腐草霉素筛选，获得抗性虫株。通过同源重组鉴定引物运用PCR鉴定，初步筛选弓形虫CK1α缺失株。分别以CK1α、ble基因为探针对弓形虫CK1α缺失株做Southern blotting鉴定，利用CK1α多克隆抗体经Westernblotting进一步鉴定，获得弓形虫CK1α缺失株。（4）弓形虫CK1α功能初步研究通过黏附、侵入、增殖、毒力试验鉴定CK1α缺失对弓形虫生物学特性的影响。结果表明，CK1α缺失株增殖速度较野生株慢（P＜0.05），证明CK1α的表达影响弓形虫增殖。流式细胞术检测细胞周期差异，结果CK1α缺失株S期高于野生株，经统计分析差异显著（P＜0.05），说明CK1α缺失导致细胞周期阻滞在S期影响虫体增殖，CK1α是弓形虫增殖的调控基因。黏附、侵入与毒力试验表明，CK1α缺失株的黏附、侵入能力及致病力与野生株差异不显著（P＞0.05）。本研究得出以下结论：（1）获得弓形虫CK1α基因并分析其进化特征，蛋白序列比对弓形虫与哺乳动物CK1α同源性低，在58%-70%之间。进化树分析弓形虫与哺乳动物CK1α亲缘关系远，CK1α具备作为弓形虫病药物治疗靶位点的条件。（2）获得弓形虫CK1α重组蛋白，分子量38kDa，通过定位其主要在弓形虫细胞质中表达，靠近细胞核稍多。（3）获得弓形虫CK1α缺失株，通过反向遗传学研究CK1α功能。结果表明，CK1α通过参与细胞周期进程对弓形虫增殖起调控作用，本研究为鉴定弓形虫病药物治疗靶点奠定基础。