实验背景及目的：近几年来，随着心血系统疾病治疗策略的进步以及溶栓术、血管成形术、冠脉搭桥术和器官移植等方法在临床的应用，使缺血的心脏组织重新得到血流灌注后，可使心脏结构、功能得到恢复和改善；但有时心脏缺血后再灌注不仅使心脏功能不能恢复，而且造成心肌组织结构和功能障碍进一步加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为心肌缺血/再灌注损伤(Myocardium ischemia/reperfusion injury，MI/RI)。心肌缺血/再灌注损伤可引起心肌细胞膜结构改变、基质中致密物增多，大量的钙沉积、线粒体水肿、膜通透性改变和细胞器断裂溶解等超微结构的改变，这些是缺血心肌可逆性损伤向不可逆损伤的病理生理转变过程。再灌后不但使心肌细胞发生上述的病理变化，同时导致心肌微血管内皮细胞（Cardiac microvascular endothelial cell,CMEC）在形态、结构和功能发生异常的病理生理性改变，血管内皮舒张因子（EDRF）减少和内皮素（ET-1）增多，微血管内皮的水肿和破坏，致使血小板与白细胞黏附、聚集、栓塞，造成心肌微血管内皮细胞凋亡(Apoptosis)或坏死。文献报道，心肌缺血/再灌注损伤时，心肌微血管内皮细胞功能和结构形态异常改变发生的时间早于心肌细胞[1]，心肌微血管内皮细胞受损引起活性氧物质的生成，释放细胞因子、生长因子、炎性组织因子、发生脂质过氧化反应，从而加重内皮细胞损伤、心肌组织结构和功能障碍。白藜芦醇（Resveratrol）是广泛存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的一种多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板黏附、聚集，调节能量代谢等生物学保护作用[2]。研究发现，白藜芦醇可抑制缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡、增强心肌组织抵抗损伤的能力，维持氧供需平衡，促进缺血心肌细胞的活力，改善心功能。近期研究证实，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路可参与缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞病理生理性损伤的发生、发展过程，并调节细胞存活、增殖分化、细胞迁移和能量代谢等生物学作用[3]；缺氧诱导因子-1α(Hypoxia induciblefactor-1α, HIF-1α)是缺氧环境下，广泛存在于人体组织和哺乳动物体内的一种生存转录调节因子，通过调控一系列与适应缺氧有关的基因的表达，促进氧转运、血管新生、抑制细胞凋亡、生存应激和能量代谢等在保持机体内氧稳态中发挥着重要的生理学作用。我们前期研究发现，白藜芦醇可抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡[4]，但是缺氧复氧前给予白藜芦醇干预是否对心肌微血管内皮细胞具有保护作用及其作用机制否是与激活PI3K/Akt/HIF-1α信号通路有关尚未见文献报道。研究目的：1.观察不同浓度的白藜芦醇对缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞活性和细胞凋亡的影响。2.探讨白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡是否通过激活PI3K/Akt/HIF-1α信号通路而实现的。实验方法：第一部分：白藜芦醇预处理对缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞的影响1．取SD雄性大鼠心脏的左心室心肌，利用酶消化法成功分离心肌微血管内皮细胞（CMEC），Dil-Ac-LDL与DAPI免疫荧光双染法鉴定细胞。2．建立心肌微血管内皮细胞缺氧复氧模型，设立对照组、缺氧复氧组、不同浓度白藜芦醇组（5、10、20、30、40μmol/L）。MTT比色法检测心肌微血管内皮细胞的活性，TUNE染色法检测心肌微血管内皮细胞凋亡，并确定白藜芦醇最适实验浓度。第二部分：PI3K/Akt/HIF-1α信号通路在白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡中的作用体外培养2-3代的心肌微血管内皮细胞（CMEC），建立缺氧复氧细胞损伤模型，并随机分为1）对照组2）缺氧复氧(H/R)组3）缺氧复氧(H/R)+20μmol/L白藜芦醇组4）缺氧复氧(H/R)+20μmol/L白藜芦醇+LY294002组。MTT比色法检测心肌微血管内皮细胞的活性；Transwell检测心肌微血管内皮细胞的迁移能力；分别以PI-AnnexinV、TUNEL染色法检测心肌微血管内皮细胞凋亡；Western-blot法检测心肌微血管内皮细胞的P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平。实验结果：1.心肌微血管内皮细胞鉴定：细胞质Dil-Ac-LDL染色阳性（呈红色荧光），细胞核DAPI染色阳性（呈蓝色荧光），证实体外所培养的细胞为心肌微血管内皮细胞（CMEC）。2. MTT、TUNEL法检测结果表明：不同浓度（5、10、20、30、40μmol/L）白藜芦醇均可提高细胞活性，抑制细胞凋亡，中浓度的白藜芦醇（20μmol/L）保护作用明显(P<0.05)，差异有统计学意义；故选定20μmol/L白藜芦醇作为最适实验浓度。3.与对照组相比，缺氧复氧组P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05)；与缺氧复氧组相比，白藜芦醇组P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与白藜芦醇组相比，缺氧复氧(H/R)+20μmol/L白藜芦醇+LY294002组CMEC的活性、迁移能力均明显降低(P<0.05)，细胞凋亡明显增加(P<0.05)，P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡可能与Ak磷酸化和上调HIF-1α蛋白表达水平有关。结论：1.不同浓度的白藜芦醇可增强缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞的活性、抑制细胞凋亡，而且在一定浓度范围内具有剂量依赖性。2.白藜芦醇可抑制心肌微血管内皮细胞凋亡，并增强细胞的活性和迁移能力，其生物学保护作用可能是通过激活PI3K/Akt信号转导通路并上调细胞HIF-1α蛋白表达水平而实现。