论文部分内容阅读
本研究以中国12个省（区）的35份马尾松种质资源为材料，摸索出适合马尾松嫩梢基因组DNA的提取方法；建立并优化了马尾松RAPD和ISSR反应体系；采用RAPD和ISSR标记，结合聚类分析，进行了我国马尾松种质资源的亲缘关系与遗传多样性研究。主要研究结果如下：1、马尾松嫩梢DNA提取方法的建立。针对马尾松嫩梢富含多糖、多酚、蛋白质等物质，采用改良的CTAB法，以新鲜幼嫩的马尾松梢部为材料，在细胞核被裂解之前，加入了用DNA提取洗净液先除糖这一步骤，能有效地消除糖类物质的干扰，这是提取高质量马尾松DNA的关键技术之一。第二是在提取液中加入2％PVP来消除酚类物质的干扰。第三，在提取过程中两次加入2％β-巯基乙醇，β-巯基乙醇是还原剂，有效地抑制了多酚及其它物质的氧化。从马尾松嫩梢中提取了较高纯度和产量的DNA，适宜作为马尾松RAPD和ISSR分析。2、马尾松RAPD和ISSR反应体系的优化。经过反复试验，本研究中建立的马尾松RAPD反应体系为：在扩增反应总体积25μL中，包含25 ng模板DNA，2.5 mmol／L MgCl2，0.8μmol／L引物，0.16 mmol／L dNTP，1.0 U Taq DNA聚合酶，1×Buffer缓冲液。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，45个循环；72℃延伸7 min，退出。ISSR最佳反应体系为：在扩增反应总体积25μL中，包含50 ng模板DNA，2.5 mmol／L MgCl2，0.5μmol／L引物，0.2 mmol／LdNTPs，1.0 U Taq DNA聚合酶，1×Buffer缓冲液。ISSR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，特定温度下退火45s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸7 min，退出。3、马尾松RAPD和ISSR标记的多态性程度分析。从200条RAPD随机引物中筛选出18条在样品间具有多态性的引物，对马尾松35份样品进行扩增，共产生153条RAPD标记条带，其中多态性带137条，多态性百分率为89.5％，平均每个引物检测到的条带数为8.5条；从60条ISSR引物中筛选出16条在所有样品中均能产生清晰扩增条带的ISSR引物，扩增共产生153条ISSR标记带，其中多态性带136条，多态性百分率为88.9％，平均每个引物检测到的条带数为9.6条。对两种标记的检测效果表明，ISSR和RAPD标记所得结果呈极显著相关，证明这两种标记技术均可用于马尾松的遗传多样性和亲缘关系研究，但ISSR效果明显优于RAPD。4、马尾松RAPD和ISSR标记的聚类分析。RAPD和ISSR标记的35份供试样品两两之间的遗传相似系数均在0-1之间。RAPD和ISSR标记分析结果的相关系数为0.711，在0.01水平呈极显著正相关。这进一步说明了两种标记聚类结果的一致性，也表明RAPD和ISSR两种遗传标记技术应用于马尾松种质资源遗传多样性研究的可行性。