【摘 要】
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甜菜碱是生物体内一类小分子渗透调节物质,在植物受到非生物胁迫时起着重要的作用。胆碱单加氧酶(Choline monooxygenase,CMO)是植物甜菜碱合成过程中的关键酶,CMO基因的表达受其
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甜菜碱是生物体内一类小分子渗透调节物质,在植物受到非生物胁迫时起着重要的作用。胆碱单加氧酶(Choline monooxygenase,CMO)是植物甜菜碱合成过程中的关键酶,CMO基因的表达受其启动子及相关转录因子的调控。分离、鉴定与CMO基因启动子上的顺式作用元件相互结合的转录因子,对分析植物的抗逆机制是十分重要的。 本论文通过筛选酵母单杂交文库,得到了可能与CMO启动子区段中Salt/drought responsive element功能元件相互结合的蛋白质,获得了编码这些蛋白的基因EST序列,选取SlASR基因进行功能研究,主要结果如下: 通过酵母单杂交文库的筛选,得到了24个与Salt/drought responsive element相互作用的蛋白质的编码基因EST序列。通过生物信息学分析发现,14个EST序列可以通过同源基因来推断基因功能,其中8个与胁迫相关,选取与ABA、胁迫、成熟相关的SlASR EST(653 bp)进行研究。 根据SlASR EST序列,RACE技术获得876 bp SlASR基因cDNA序列,其中开放阅读框(ORF)714 bp,编码237个氨基酸。序列分析表明该基因具有ABA_WDS保守结构域,属于ASR基因家族。对该基因编码蛋白的分子量、理论等电点、跨膜结构、磷酸化位点、亚细胞定位和折叠特征进行了预测。将该序列提交到 GenBank后获得登录号KC460335。 利用实时荧光定量PCR分析显示,非胁迫条件下,SlASR基因在辽宁碱蓬叶、茎、根中均有表达。在叶中的表达量远高于其在根、茎中的表达;SlASR基因在辽宁碱蓬叶中的表达受高盐、低温、干旱和ABA胁迫诱导。 基因枪法转化洋葱表皮细胞瞬时表达实验表明,GFP-SlASR融合蛋白特异性定位在细胞核中。酵母转录激活实验证明在酵母株系 AH109体内,SlASR无转录激活活性。尽管SlASR无转录激活活性,但是其定位于细胞核,并且能和Salt/drought responsive element相结合,因此SlASR是能够与DNA直接结合的核蛋白,可能通过其他核蛋白的帮助来行使转录激活作用。 蘸花法转化拟南芥,获得了SlASR基因超量表达的转基因拟南芥株系。超表达SlASR基因的转基因株系在外部形态上没有发生变化,其对干旱、低温及高盐胁迫的耐受能力显著提高。
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