【摘 要】
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目的:本研究通过表达纯化具有良好抗原性和结构高度保守的非洲猪瘟病毒p30、p72和MGF360-12L的重组蛋白,利用三种重组蛋白作为免疫原制备针对p30、p72和MGF360-12L的特异性单克隆抗体,将三种单克隆抗体联合应用,研制ASFV抗体竞争ELISA快速检测试剂盒。方法:1.重组蛋白的表达纯化含有重组质粒pMAL-c6T-p30、pMAL-c6T-p72和pET-28a-MGF360-1
【基金项目】
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贵州省自然科学基金,杜仲苷逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药的作用及机制研究（黔科合基础[2019]1331号）；
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目的:本研究通过表达纯化具有良好抗原性和结构高度保守的非洲猪瘟病毒p30、p72和MGF360-12L的重组蛋白,利用三种重组蛋白作为免疫原制备针对p30、p72和MGF360-12L的特异性单克隆抗体,将三种单克隆抗体联合应用,研制ASFV抗体竞争ELISA快速检测试剂盒。方法:1.重组蛋白的表达纯化含有重组质粒pMAL-c6T-p30、pMAL-c6T-p72和pET-28a-MGF360-12L的基因工程菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析鉴定其表达纯化情况,BCA法测定纯化蛋白浓度。2.单克隆抗体的制备分别利用纯化的ASFV p30、p72和MGF360-12L蛋白作为免疫原,按常规方法免疫6-7周龄雌性BALB/C小鼠,间接ELISA法检测小鼠尾血效价,融合前3天腹腔注射冲击免疫,选择免疫效价高的小鼠,利用PEG 1500将SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞按1:5进行细胞融合,融合后第10天间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化,交叉试验检测细胞特异性,对筛选到的杂交瘤细胞进行抗体亚类的测定,腹水诱生法大量制备单克隆抗体,正辛酸硫酸铵法纯化单克隆抗体,HRP标记单克隆抗体,间接ELISA检测标记后抗体效价。3.ASFV抗体竞争ELISA快速检测试剂盒的研制ASFV p30、p72和MGF360-12L蛋白作为包被原,竞争ELISA法优化反应条件,制备的ASFV p30、p72和MGF360-12L特异性酶标单克隆抗体联合应用作为竞争抗体,建立ASFV抗体竞争ELISA快速检测方法,用优化的竞争ELISA试剂盒对SIV、PRV、PCV、PPV、PRRSV阳性血清以及数份ASFV阴性血清进行检测,对该方法的临界值、敏感性、特异性和符合率进行评估。结果:IPTG对p30、p72和MGF360-12L重组蛋白诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳结果显示,p30、p72和MGF360-12L重组蛋白表达纯化成功,分子量大小分别约为65 KDa、73.2 KDa和43.2 KDa。BCA法测定纯化蛋白浓度,p30、p72和MGF360-12L纯化蛋白浓度分别为6.30 mg/m L、10.18mg/m L和6.18 mg/m L。免疫后小鼠尾血效价均大于1:16000。间接ELISA法检测杂交瘤细胞及亚克隆细胞的培养上清,获得了能稳定分泌特异性单克隆抗体、无交叉、特异性强且均属于Ig G亚类的杂交瘤细胞株,分别命名为p30-35、p30-80,p72-37、p72-41和MGF360-12L-8、MGF360-12L-20。纯化后的单克隆抗体效价均大于1:32000,HRP标记单克隆抗体效价均大于1:3200。竞争ELISA法优化各反应条件,p30、p72和MGF360-12L纯化蛋白最佳包被浓度分别为0.5μg/m L、0.5μg/m L和0.25μg/m L,最佳包被条件均为碳酸盐缓冲液（Carbonate Buffer solution,CBS）、4℃包被12 h,最佳封闭条件均为5%脱脂奶粉、37℃封闭2 h,血清样本1:8稀释,酶标抗体最佳稀释倍数均为1:3200,最佳竞争时间为1 h,最佳显色条件均为37℃避光显色20 min,与SIV、PRV、PCV、PPV、PRRSV检测结果均为阴性,临界值测定PI≤25.68%判定为阴性,PI≥27.27%判定为阳性,25.68%≥PI≥27.27%判定为可疑,敏感性为1:128,符合率为97.5%。结论:成功制备了ASFV p30、p72和MGF360-12L的特异性单克隆抗体,研制的竞争ELISA检测试剂盒具有良好的特异性和敏感性,可为ASFV的预防和大规模血清样品的检测提供有效监测工具,为ASFV疫苗免疫效果的评估提供有效技术手段。
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