Smac模拟物SM-164对乳腺癌的放射增敏作用和机制研究

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乳腺癌是女性最常见的肿瘤,是女性首要的肿瘤死亡原因。放射治疗在乳腺癌的局部控制,特别是对于进行保守性手术病人,发挥关键性作用。但是肿瘤细胞固有的放射抵抗性降低了放射治疗的效果。IAPs家族的主要作用是通过与活性的caspase-3、-7和-9结合,并且阻碍它们的功能,最终抑制凋亡形成、使肿瘤细胞得以存活。XIAP、cIAP-1和cIAP-2是IAPs家族的主要成员。Smac是一种线粒体蛋白,在凋亡过程中从线粒体中释放,激活被cIAP-1、XIAP等阻滞的caspase。SM-164是一个模拟Smac作用的小分子化合物。BCL-2家族对细胞凋亡发挥着开关的作用。BM-771是一种新合成的BCL-2抑制剂,可以拮抗BCL-2家族的抗凋亡作用。目的:评价SM-164在乳腺癌细胞中的放射增敏作用,探讨SM-164放射增敏的作用机制。评估BM-771在乳腺癌细胞中的放射增敏作用。方法:(1)采用免疫印迹法检测6个常见乳腺癌细胞的IAPs和BCL-2家族蛋白表达和SM-164对cIAP-1的降解作用。利用ATPlite法分析SM-164和BM-771对肿瘤细胞的生长活性抑制。采用克隆形成实验评价SM-164和BM-771的放射增敏作用。(2)细胞(SK-BR-3和MDA-MB-468)被分为4组:对照组、SM-164治疗组、X线照射组和联合治疗组。通过观察细胞形态变化、FACS分析、DNA梯度分析、活性PARP和活性caspase-3蛋白表达来确定SM-164的放射增敏的性质。利用ELISA方法检测caspase活性。利用caspase抑制剂和siRNA沉默阻断SM-164的放射增敏作用。结果:(1)乳腺癌细胞具有IAPs和BCL-2家族蛋白的异常表达。在4个cIAP-1高表达的乳腺癌细胞,SM-164能引起乳腺癌细胞cIAP-1的快速降解。高表达cIAP-1的乳腺癌细胞株对BM-771敏感,但BM-771无放射增敏作用;SM-164被大部分高表达cIAP-1的乳腺癌细胞株耐受,使用纳摩尔级的治疗浓度,在SM-164耐受(SK-BR-3)和敏感(MDA-MB-468)的细胞株都发现放射增敏作用,SER分别为1.70和1.81。正常乳腺上皮细胞MCF-10A不表达cIAP-1,SM-164对其无明显的细胞毒性。(2)SK-BR-3和MDA-MB-468细胞在接受SM-164和X射线联合治疗后,出现皱缩、分离、脱落等凋亡形态学变化;FACS分析显示凋亡细胞有明显增加(P<0.05);DNA梯度分析显示,在SM-164耐受的SK-BR-3细胞,典型的180-bp的DNA片段显著出现在联合治疗组;在SM-164敏感的MDA-MB-468细胞,SM-164引起可观的DNA片段,且在联合射线治疗后进一步增加;活性PARP和活性caspase-3蛋白表达显示二者被大量的激活;这些结果强烈支持SM-164的放射增敏是由于促进凋亡形成,并且caspase激活有关。在caspase-3、-8和-9活性分析中,联合治疗引起SK-BR-3细胞出现以caspase-9、-3的激活(P<0.01),但caspase-8未见激活;引起MDA-MB-468细胞明显的caspase-3、-8和-9激活(4、5和8倍,P<0.05或P<0.01)。SM-164的放射增敏在SK-BR-3细胞是通过激活caspase-9、-3,引起内源性线粒体通路介导的凋亡;在MDA-MB-468细胞是通过激活caspase-9、-8和-3,引起内源性线粒体和外源性死亡受体通路介导的凋亡。在两个细胞株中,泛caspase抑制剂(z-VAD-fmk)可抑制联合治疗的凋亡DNA片段形成和大部分阻断和SM-164的放射增敏。siRNA沉默(caspase-9和caspase-3)可以阻断SM-164增加的放射凋亡和放射增敏作用,SER从1.57降低到1.27(caspase-9)或1.23(caspase-3);siRNA沉默caspase-8则没有效果,SER从1.57降到1.55。结论:SM-164是一个高效、潜在的新型乳腺癌放射增敏药物,具有较小的细胞毒性。BCL-2家族抑制剂BM-771具有直接的乳腺癌细胞杀伤作用,但不能增加乳腺癌细胞的放射敏感性。SM-164在乳腺癌中放射增敏作用的机制主要是通过激活caspase来实现的。SM-164去除caspase的抑制剂cIAP-1和XIAP,导致caspase-9和-3的激活,通过DNA损伤通路促进凋亡形成。
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