目的:炎性细胞浸润是直接导致肾脏炎症发生发展的重要因素,Fractalkine作为第一个被人们发现的细胞表面的趋化因子,能有效介导单核细胞、NK细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞黏附和趋化。Fractalkine与其特异性受体—CX3CR1介导的炎症细胞的黏附以及趋化,与机体多种生理病理过程相关。TNF-α是一种具有多种生物活性的细胞因子,生理情况下在抵抗炎症、促进修复等方面具有重要作用,但是在病理情况下则会破坏免疫平衡导致机体产生损伤。骨化三醇(1,25-(OH)2D3),作为维生素D3的活性形式不仅在体内的钙磷代谢中发挥着重要的作用,同时在免疫调节中也起着重要的作用。因此,围绕炎症状态下fractalkine在肾损伤的发病机制和防治方面的研究近年来备受重视。本实验拟通过TNF-α干预肾小管上皮细胞(Human kidneyproxiamal tubular cells-2,HK-2)建立肾脏炎症损伤的模型,研究肾小管上皮细胞(HK-2)上的趋化因子fractalkine的表达的变化以及其对单核细胞THP-1的趋化作用的影响。在此基础上再加入骨化三醇进行干预,探讨骨化三醇对于TNF-α刺激后的HK-2肾小管上皮细胞的保护作用。方法:1细胞培养:人近端肾小管上皮细胞株HK-2和人单核细胞细胞株THP-1是本院病原生物与免疫学教研室保存细胞株。(1)HK-2用含体积分数10%FBS的D-MEM/F-12培养基培养至80%~90%融合度时,继续用体积分数为0.05%FBS的D-MEM/F-12培养基培育24 h。设计实验并分组:(1)正常细胞培养组(2)TNF-α干预组:40 ng/ml TNF-α干预不同时间点(0、1、6、12、24、48 h)后检测HK-2细胞fractalkine的表达;不同浓度的TNF-α(0、10、20、40 ng/m L)干预24 h后检测HK-2细胞fractalkine的表达。(3)骨化三醇作用组:40 ng/ml TNF-α作用HK-2细胞24 h后,用不同浓度梯度(10-9 mol/L、10-10 mol/L、10-11 mol/L)的骨化三醇作用12 h检测HK-2细胞fractalkine的表达。(2)THP-1细胞用RMPI-1640培养基进行培养。?正常对照组:在下室仅加入无血清的DMEM/F12培养基,观察THP-1的随机移动?单纯TNF-α组:仅在下室加入含TNF-α的无血清培养基观察THP-1的移动。?未刺激组:未受到TNF-α刺激的HK-2细胞对于THP-1的趋化作用。?TNF-α实验组:观察用TNF-α干预后的HK-2细胞对THP-1细胞的趋化作用的影响。?Fractalkine中和抗体组:加入(1 ng/m L,5ng/m L)中和抗体后观察HK-2细胞对THP-1细胞的趋化作用的影响。?骨化三醇实验组:加入10-9 mol/L骨化三醇后观察HK-2细胞对THP-1细胞的趋化作用的影响。上述每组实验均设3~5个复孔,并重复3次实验。2采用MTT法检测TNF-α以及骨化三醇干预后对于HK-2细胞活力的影响。3采用Annexin V-FITC/PI流式法分析TNF-α以及骨化三醇对各实验组人肾小管上皮细胞(HK-2)的凋亡率的影响。4采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)检测各组细胞培养上清液中fractalkine的含量。5采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)以及实时荧光定量PCR检测经不同干预后的各组细胞fractalkine的m RNA表达水平。6采用Western Blot法检测经不同刺激后的各组细胞fractalkine的蛋白的表达水平。7采用免疫荧光技术检测经TNF-α干预后fractalkine在HK-2细胞上的主要表达部位。8采用含聚碳酸酶微孔滤膜的Transwell装置检测各实验组的HK-2细胞对THP-1细胞的趋化作用的影响。结果:1 TNF-α及骨化三醇干预后对于人肾小管上皮细胞(HK-2)存活率有显著的影响。TNF-α对HK-2细胞的存活率有着时间与剂量效应的影响。随着TNF-α使用的浓度以及时间的增加,HK-2细胞的存活率随之降低,与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。在TNF-α干预后加入不同浓度的骨化三醇则发现细胞的存活率逐渐上升,在10-9 mol/L时,HK-2细胞增殖最明显,与TNF-α组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2骨化三醇对经TNF-α诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响经TNF-α刺激的HK-2细胞凋亡率明显升高,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。在此基础上使用不同浓度的骨化三醇作用一定的时间后,结果发现HK-2细胞的凋亡率显著下降,与TNF-α刺激组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在10-9 mol/L时,HK-2细胞凋亡率下降最明显。3骨化三醇对经TNF-α诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)上清液fractalkine含量的影响经TNF-α干预的HK-2细胞上清液中的fractalkine的含量较空白对照组升高(P<0.05)。经不同浓度梯度的骨化三醇作用后,HK-2细胞上清液中的fractalkine的含量所有降低,与TNF-α刺激组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4 TNF-α干预人肾小管上皮细胞(HK-2)后呈时间和剂量依赖性上调fractalkine m RNA和蛋白的表达。检测不同浓度的TNF-α作用于HK-2细胞24 h后,fractalkine的表达量随着TNF-α使用剂量的增加而逐渐增加。未受到TNF-α刺激的HK-2细胞仅表达少量的fractalkine。同样的,用40 ng/ml的TNF-2诱导HK-2细胞,发现fractalkine的表达量具有一定的时间效应。其表达量随着时间的增加逐渐增多,正常组的HK-2细胞仅表达少量的fractalkine。与正常组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。5骨化三醇具有逆转TNF-α对于人肾小管上皮细胞(HK-2)的刺激作用,可下调HK-2细胞上fractalkine m RNA和蛋白的表达,并上调HK-2细胞VDR的m RNA和蛋白的表达。40 ng/ml TNF-α作用HK-2细胞24 h后,用不同浓度梯度的骨化三醇再作用12 h后,检测HK-2细胞fractalkine的m RNA和蛋白的表达发现与TNF-α单纯刺激组比较,fractalkine的表达量明显降低(P<0.05)。同时,对HK-2细胞上的骨化三醇的相应受体VDR检测发现,TNF-α下调HK-2细胞的VDR m RNA和蛋白的表达(P<0.05),而骨化三醇可以逆转TNF-α对于HK-2细胞的刺激作用,上调HK-2细胞VDR的m RNA和蛋白的表达(P<0.05)。6 Fractalkine的亚细胞定位主要位于人肾小管上皮细胞(HK-2)的细胞膜上用TNF-α对HK-2细胞进行干预,以未受到TNF-α作用的HK-2细胞作为对照,在倒置荧光显微镜下进行观察,发现绿色荧光主要分布在HK-2细胞的细胞膜部位,说明fractalkine的亚细胞主要位于细胞膜上面。7经TNF-α干预的人肾小管上皮细胞(HK-2)对THP-1细胞的趋化作用增强,加入中和抗体以及骨化三醇后,其趋化作用减弱。正常对照组以及单纯TNF-α组未见到迁移的THP-1细胞。未刺激的HK-2细胞对于THP-1细胞有较弱的趋化作用,与正常对照组及单纯TNF-α组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-α刺激24 h组的HK-2细胞对于THP-1细胞的趋化作用有所增强,与前三组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。fractalkine中和抗体组的HK-2细胞对THP-1细胞的趋化产生了抑制作用,浓度越高的中和抗体抑制趋化作用越明显,与TNF-α组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。骨化三醇干预组的HK-2细胞对THP-1细胞的趋化作用有所减弱,与TNF-α组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1 TNF-α刺激HK-2肾小管上皮细胞后上调fractalkine的表达并具有时间和剂量依赖性,fractalkine的表达位点主要在细胞膜上。2骨化三醇可以逆转TNF-α对fractalkine的上调作用,上调的fractalkine使HK-2细胞对于THP-1细胞的趋化作用增强而fractalkine中和抗体和骨化三醇则减弱其趋化作用。提示骨化三醇对于肾小管的炎症性损伤具有一定的保护作用。