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牙菌斑生物膜(Dental plaque biofilm)是龋病发生的始动因子,菌斑中致龋菌通过多个毒力因子在龋病的发生过程中发挥重要作用,主要表现在粘附、产酸和耐酸三个环节。其中耐酸是致龋菌最重要的生物学特征同时也是龋病发生的前提,只有能耐受酸性环境,致龋菌才能继续代谢并产酸,最终导致釉质发生脱矿而引起龋病的发生。质子移位膜ATP酶(membrane-bound proton-translocating ATPase, F0F1ATPase, F-ATPase, H+-ATPase, F-type ATPsae)能通过转运质子于胞外以维持细胞内相对中性的环境,从而保护胞内的对酸敏感的酶和其他蛋白,使致龋菌具有对抗酸致死的能力,并在低pH条件下存活继续产酸,从而达到临界pH使釉质脱矿,因此,F-ATPase是致龋菌最重要的耐酸毒力因子。牙菌斑生物膜是致龋菌致病的原位环境,它并非细菌结构上简单叠加,而是构建起复杂的微生物群落,具有生物膜结构和微生物生理学的功能,生物膜内细菌之间存在相互拮抗、相互依赖以及信号传导,启动一套完全不同于浮游状态的基因系统,影响致龋菌毒力因子表达和毒理作用,故观察生物膜中F-ATPase的表达能真实准确地反应致龋菌耐酸毒力因子在龋病发生发展过程中的作用。目的：本课题检测耐酸因子F-ATPase在多细菌人工口腔生物膜(体外生物膜,artificial biofilm, in vitro biofilm)和临床不同龋敏感个体原位菌斑中的基因表达特点及酶的活性,并观察F-ATPase启动子荧光报告基因重组质粒转化的细菌在不同pH生物膜环境中的荧光表达,初步分析毒力因子F-ATPase在生物膜中基因和蛋白的表达水平,对进一步明确龋病的病因、疾病风险性评估以及防治均有重要意义。方法：一、荧光定量PCR检测人工口腔生物膜中F-ATPase在不同pH条件下的mRNA表达差异以变异链球菌(S. mutans)、血链球菌(S.sanguis)、远缘链球菌(S.sobrinus)、内氏放线菌(A. naeslundii)、粘性放线菌(A. viscosus)、口腔链球菌(S.oralis)和奈瑟氏菌(Neisseria)8种口腔与龋相关菌构建口腔体外生物膜模型,不同pH环境中生长3h后,提取生物膜样本的RNA,逆转录cDNA,荧光定量PCR (SYBR Green I)检测F-ATPase的mRNA表达。单因素方差分析统计结果。二、荧光定量PCR检测不同龋敏感个体牙菌斑生物膜中F-ATPase的mRNA表达分别采集成年人高龋(61例)和无龋(50例)、老年人根面高龋(56例)和根面无龋(41例)人群的牙菌斑,提取菌斑RNA,逆转录cDNA,荧光定量PCR (SYBR GreenⅠ)检测牙菌斑F-ATPase的mRNA表达。单因素方差分析统计结果。三、人工口腔生物膜中F-ATPase的酶活性表达实验一相同方法构建人工口腔生物膜,制备混合细菌生物膜透性细胞,以检测不同pH条件下磷的释放量来反映F-ATPase酶活性。单因素方差分析统计结果。四、前期构建的F-ATPase启动子转化菌生长及重组荧光表达载体在人工口腔生物膜中的荧光表达特点课题前期构建的F-ATPase启动子绿色荧光蛋白穿梭载体PLFgfp和管家基因recA红色荧光蛋白穿梭载体PLRred,质粒DNA电击转化变异链球菌(UA159),观察不同pH条件的生长菌在含卡那霉素BHI琼脂平板的菌落生长情况,激光共聚焦扫描显微镜观察两种穿梭载体在大肠杆菌中不同pH生物膜条件下荧光的表达。结果：1.人工口腔生物膜中F-ATPase在不同pH条件下表达不同,在初始pH 5和5.5时F-ATPase表达最高,然后依次是初始pH 6、6.5、4.5、7,在初始pH 4时表达最低。酸性环境相对中性环境(pH 7) F-ATPase的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。2.高龋组人群F-ATPase的表达明显高于无龋组(P<0.01),高龋组中成年人F-ATPase的表达高于老年人(P<0.01),而无龋组中成年人与老年人差异无统计学意义(P>0.05)。F-ATPase在临床个体原位牙菌斑生物膜中的表达远远高于人工口腔生物膜(P<0.01)。3.在酸处理初期前10min, F-ATPase活性随pH升高而降低；经过3h稳定培养后,pH 5和5.5时活性最高,其他依次是pH 6、pH 4.5、pH 6.5、pH 4,在pH 7时活性最弱。相对中性环境(pH 7)酸性环境F-ATPase的活性差异均有统计学意义(P<0.05)。4. F-ATPase启动子重组质粒电击转化后的变异链球菌能够生长在含卡那霉素的BHI平板上,PCR扩增结果证实转化成功,转化菌在pH 5.5的卡那霉素抗性平板上生长率最高,然后依次是pH 5、pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 4.5,生长率最低的是pH 4,结果类似于不同pH培养后的多细菌人工口腔生物膜F-ATPase的表达。F-ATPase启动子及内参照recA启动子重组质粒转化后的大肠杆菌同实验一条件构建不同pH人工口腔生物膜,激光共聚焦扫描显微镜下观察荧光表达,结果显示：绿色荧光(F-ATPase启动子重组质粒)在初始pH为5.5的条件中表达最多,然后依次是初始pH 5、pH 6、pH 4.5、pH 6.5、pH 4和pH 7,而红色荧光(内参照recA启动子重组质粒)的表达在初始pH 7时最高,随着pH降低减少,在初始pH 4时表达较少。结论：生物膜中,pH值影响F-ATPase基因和活性的表达,在初始pH 5-5.5环境中基因表达和酶活性都最高,变异链球菌F-ATPase启动子荧光蛋白在初始pH 5.5环境中表达也最强(pH 5-5.5是牙釉质脱矿与再矿化失衡致龋病发生的临界pH)；高龋人群原位菌斑中F-ATPase表达远远高于无龋人群,可见菌斑生物膜中的致龋微生物通过F-ATPase的基因表达上调和蛋白表达增强在低pH环境中酸耐受并致龋。