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流感病毒至今仍是威胁人类和动物生命安全最具破坏性的病原体之一,其中流行范围最广、危害最严重的为A型流感病毒。在分类上,A型流感病毒(Influenza A virus, IAV)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae Family)流感病毒属。依据血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性的差异,A型流感病毒又可进一步分为18个HA亚型和11个NA亚型。A型流感病毒的基因组为8个节段的单股、负链RNA,并且具有广泛的感染宿主,这些特性使其在复制过程中很容易发生变异和重组。其中非结构蛋白NS1在病毒感染早期就开始表达并进入宿主细胞核与多种因子发生相互作用,参与病毒的复制周期以及拮抗宿主的干扰素系统等等。但关于这方面的报道还相对较少,NS1调控的具体机制还不甚明了。为此,本研究选取不同亚型流感病毒的NS1,探讨其在宿主细胞核内与何种宿主因子发生相互作用以及如何调控病毒的复制及其毒力,旨在为深入研究流感病毒的复制周期和寻找潜在的药物治疗靶点提供一定的理论基础。1.不同亚型流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析2013年2月,一种新型的H7N9流感病毒跨物种感染人并造成感染患者死亡。为了溯清人感染H7N9的源头,本研究从人感染H7N9的活禽交易市场采集样本,包括5份环境样本、1份鹌鹑咽拭子、1份鸭的肛拭子和11份鸡的咽、肛拭子共18份样品。宏基因组测序分析显示这些样本中存在着H5、H7、H9、 N1、N2、N9不同亚型流感病毒的混合感染。随后,本研究从这些样本中分离出H5N9、H7N9和H9N2亚型流感病毒。系统进化分析结果表明：该H5N9毒株的HA基因来源于A/Muscovy duck/Vietnam/LBM227/2012(H5N1),属于2.3.2.1分支。NA基因来源于A/Hangzhou/1/2013(H7N9)。其6个内部基因与H5N1、H7N9、H9N2的同源性最高。该毒株的HA裂解位点为PQRERRRKR/GL,是典型的高致病性禽流感病毒的裂解位点。受体结合试验表明：该毒株仅与a-2,3唾液酸受体结合,而不与a-2,6受体结合。该H5N9亚型高致病性禽流感病毒为H5N1、H7N9与H9N2亚型流感病毒的三源重组病毒。活禽交易市场对公共卫生及养禽业构成了一种潜在的传播风险。2.宿主核不均一核糖核蛋白C2 (Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein C2, hnRNP C2)与A型流感病毒NS1的相互作用关系研究在A型流感病毒感染宿主的过程中,NS1作为一种多功能调节蛋白可与多种宿主蛋白发生相互作用。hnRNP C2是真核生物细胞核内含量较为丰富的蛋白之一,对宿主细胞mRNA前体的剪切、加工、运输等等具有重要的作用。本研究发现在不同亚型流感病毒(H3N2、H7N9、H9N2、H1N1和H5N9)感染人肺上皮细胞系(A549)的过程中,NS1基因与宿主hnRNP C2存在共定位并在细胞核中呈现弥散或团块状聚集。通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)、RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation, RNA-IP)和GST Pull-Down试验,本研究发现NS1与hnRNP C2之间存在相互作用,这种互作需要RNA的参与但对RNA的种类不具有特异性,RNA在NS1与hnRNPC2之间起到一种桥梁的作用。这种互作在A型流感病毒中普遍存在,是一种保守的现象。精细定位研究结果表明：hnRNP C2的互作区域在氨基酸(amino acid, aa)aa.107-119即hnRNP C2比hnRNP C1多出的13个氨基酸。NS1的互作区域在N端前73个氨基酸的RNA结合域(RNA Binding Domain, RBD)。通过对NS1 N端1-73的氨基酸序列及其二聚体结构分析,该区域分为3个α螺旋：α螺旋1,aa.3-25；α螺旋2,aa.30-50;α螺旋3,aa.54-69。这一区域带正电荷的碱性氨基酸可直接与RNA骨架中带负电荷的磷酸基团相结合。本研究应用丙氨酸扫描(Alanine Scanning)的方法对这3段区域带正电荷的碱性氨基酸精氨酸(Arginine, R)和赖氨酸(Lysine, K)依次突变为丙氨酸(Alanine, A),并构建一系列的突变体载体。随后的Co-IP试验结果显示：当aa.19-21连续突变为A(R19AK20AR21A)、aa.35-46连续突变为A (R35AR37AR38AK41AR44AR46A)以及R35A、R37A、R38A、K41A、R46A和R38AK41A的单点或双点突变体均无法与Myc-hnRNPC2互作。即这些氨基酸位点对互作起决定性作用。为了进一步分析带有以上突变位点的重组病毒是否失去与内源性hnRNPC2互作的能力,本研究利用A型流感病毒8质粒反向遗传操作系统拯救带有单点突变及多点突变氨基酸的重组病毒,Co-IP试验结果表明：突变体病毒均不再与内源性hnRNP C2互作。将这些突变体病毒在鸡胚中连续传代至第7代(F7)时,各毒株均能够稳定传代,但Mut.19-21和R35A突变体病毒在NS1的39位氨基酸都有D39N和D39G的伴随性突变。突变体病毒Mut.35-46的复制能力减弱HA仅为6 log2,对鸡胚的致死时间也延长到40 h,但对鸡胚的ELD50与其它病毒无明显区别。突变体病毒Mut.35-46在MDCK细胞上的增殖滴度大大减弱,约为野生型病毒的千分之一。3.宿主hnRNP C2在A型流感病毒感染过程中的功能研究在293T细胞系中过表达Flag-hnRNP C2后可明显抑制H5N9亚型流感病毒基因组病毒RNA (virus RNA, vRNA)、互补链RNA (complementary RNA, cRNA)及信使RNA (message RNA, mRNA)的复制和转录。与过表达Flag-N空载对照组相比,过表达Flag-hnRNP C24 μg时,vRNA、cRNA和mRNA的复制和转录水平下降的尤为明显,进而影响病毒蛋白的翻译,并使病毒在MDCK细胞中的增殖能力减弱。同理,在hnRNP C2沉默的A549细胞系中感染H5N9,与无关干扰对照组相比,hnRNP C2沉默组中H5N9亚型流感病毒基因组vRNA、 cRNA及mRNA的复制和转录水平明显增强,进而促进病毒蛋白的翻译,并使其在MDCK细胞中的增殖滴度上升。