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目的:
通过构建野生型及突变型MPLexon10基因的慢病毒表达载体，包装含有各目的基因片段的慢病毒，为后续研究MPLexon10新基因突变体MPLA497-L498LVIAins的功能奠定基础。
方法:
1.构建MPLA497-L498LVIA ins及对照基因的真核表达载体
应用RT-PCR方法扩增MPL exon10新基因突变体(MPLA497-L498LVIA ins)及野生型MPL（MPLWT）的全长CDS编码区域，分别通过酶切、连接反应，构建其慢病毒表达载体并依次命名为pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins及pCDH1-MPLWT重组质粒。以pCDH1-MPLWT的重组质粒为模板，通过定点诱变技术构建MPL热点突变体(MPLW515L)表达载体，并命名为pCDH1-MPLW515L重组质粒。
2.构建MPLA497-L498LVIA ins及对照基因的慢病毒表达体系
采用最佳的质粒配比比例，将构建成功的表达质粒分别与包装质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV和pVSV-G通过磷酸钙共沉淀法转染293T细胞，包装慢病毒颗粒，用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测转染效率。
3.慢病毒感染293T细胞，测定病毒滴度
收集的慢病毒浓缩液分梯度直接感染293T细胞，于96小时激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光表达，计数最后一个能观察到荧光的孔内的阳性细胞数，按公式计算病毒滴度(TU/ml)=最后一孔荧光细胞数/稀释倍数×103。
结果:
1.经酶切，测序鉴定，慢病毒表达载体pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins、pCDH1-MPLW515L和pCDH1-MPLWT重组质粒构建成功。
2.利用基因工程技术构建三种目的基因的慢病毒表达体系，经激光共聚焦显微镜及流式细胞术转染效率分别pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins为75.2％、pCDH1-MPLW515L为81.4％和pCDH1-MPLWT为69.9％，三种慢病毒表达体系成功构建。
3.测定病毒滴度分别为MPLA497-L498LVIA ins4×108TU/ml，MPLW515L4×109TU/ml，MPLWT1×106TU/ml，满足后续实验需要。
结论:
本课题设计并成功构建MPL exon10新突变体-MPLA497-L498LVIA ins，热点突变MPLW515L及MPL野生型的慢病毒表达载体;建立了成熟的慢病毒包装技术，其所产生的病毒滴度较高，可以满足后续该新突变在细胞株以及小鼠模型功能实验研究。