本文的研究对象为棉铃虫齿唇姬蜂Campoletis chlorideae Uchida,它是世界重大经济害虫棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)的优势种寄生蜂。本课题组从田间采样发现了该蜂卵巢发育异常的现象,基于此,我们首先进行了转录组测序,筛选出卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)及其受体(Vitellogenin receptor,VgR)2个生殖相关基因作为本研究的重点,研究其表达模式。并通过Bt(苏云金芽孢杆菌,Bacillus thuringiensis)Cry 1Ac毒蛋白处理,探明Cry 1Ac毒蛋白对该蜂生长发育及对Vg和VgR基因转录表达水平的影响。进一步,围绕雌蜂生殖异常,从解毒酶P450的2个基因进行了对比研究,希望通过昆虫的解毒机制来探明棉铃虫齿唇姬蜂卵巢发育异常的原因。取得以下结果。一、棉铃虫齿唇姬蜂卵黄原蛋白Vg基因表达模式卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)是昆虫卵巢发育和卵子发生的关键蛋白。目前,有关寄生蜂卵黄原蛋白的研究明显不足,而有关幼虫内寄生蜂是否存在卵黄原蛋白尚无定论。首先,基于棉铃虫齿唇姬蜂雌蜂转录组数据,获得了该蜂Vg序列(命名为:CcVg),通过多重联配分析、系统进化树构建,取得以下结果:Cc Vg的cDNA全长序列,为5866 bp,ORF全长5340bp,编码1779个氨基酸,蛋白分子量为220.63 kDa,N端包含了一个16个氨基酸的信号肽。该蜂Vg序列具有典型的vitellogenin超家族基因结构域,它与日本黑瘤姬蜂Pimpla nipponica亲缘关系最近。通过荧光定量PCR(q-PCR)等方法检测卵巢发育异常雌蜂Fg转录水平,与正常雌蜂相比,其Fg基因表达量显著上升。进一步,对该基因的时空动态表达模式进行了详细研究。结果显示,Fg基因在蜂的幼虫期表达量很低,随后是一个逐渐上升的过程,尤其在结茧当天和羽化当天它的表达量显著上升,并随成虫羽化日龄的增加总体呈上升趋势。与大多数文献报道Fg是雌性特异基因不同,在雄蜂中也发现了 Vg基因的表达,其表达模式不同于雌蜂的,在羽化后1-2d达到高峰。但总体而言,雌蜂Fg基因的表达量显著高于雄性的,且均以脂肪体为主要的合成部位。开展棉铃虫齿唇姬蜂卵黄原蛋白基因的表达模式不仅可以丰富寄生蜂生殖生物学理论,而且还能为该蜂的人工成功繁育提供理论依据和实践指导。二、棉铃虫齿唇姬蜂卵黄原蛋白受体VgR基因表达的特征卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor,VgR)是卵黄原蛋白的专一性受体,与卵巢发育和卵黄发生密切相关。与Vg相比,寄生蜂VgR的研究更为缺乏。因此,明确寄生蜂卵黄原蛋白受体VgR基因的表达模式将可为其功能的深入研究奠定基础。基于转录组数据,通过荧光定量PCR(q-PCR)等试验方法,首先对田间棉铃虫齿唇姬蜂卵巢发育异常个体进行FgR基因表达量的检测,发现其表达量显著下降。雌蜂VgR基因的表达量从幼虫期开始低量表达,经过蛹期到成虫期,大体上是一个逐渐上升的过程,且在结茧后4d有一个小高峰,在羽化后12d达到最高峰,这与Vg相类似,说明两者具有协同性。雄蜂VgR基因在结茧后2-4d有一个高水平的表达,但在初羽化0d雌蜂表达量是雄峰的11.0倍,说明该基因也非雌性特异。VgR主要在卵巢中表达,但在雌蜂、雄峰的脂肪体以及雄峰的表皮中也有少量表达,推测与非营养功能有关。三、Cry 1Ac毒蛋白对棉铃虫齿唇姬蜂生长及生殖发育的影响大量研究表明,转Bt基因作物的大范围种植对天敌昆虫并不亲和。结合田间棉铃虫齿唇姬蜂卵巢发育异常的现象,以Cry 1Ac蛋白作为外源毒物,探明其对天敌寄生蜂生长及生殖发育相关基因的影响。首先,用Cry 1Ac饲喂寄主棉铃虫2龄幼虫,其体重显著降低,说明毒蛋白抑制了棉铃虫的生长。因棉铃虫齿唇姬蜂具有补充营养的习性,用混合了 Cry 1Ac蛋白的蜂蜜水饲喂该蜂,成蜂寿命显著缩短,且具有剂量效应。被棉铃虫齿唇姬蜂寄生后的棉铃虫幼虫取食了 Cry 1Ac处理的饲料后,对体内的棉铃虫齿唇姬蜂的生长发育产生了显著抑制作用,结茧率下降,羽化率显著降低仅50.2%,蜂体明显变小,与对照相比达到了显著水平(p<0.05)。运用实时荧光定量PCR方法,对棉铃虫齿唇姬蜂生殖发育的关键基因Fg和VgR的转录水平进行检测,研究结果显示,从经Cry 1 Ac蛋白处理的被寄生棉铃虫育出的雌、雄蜂Fg和VgR的mRNA表达量均显著下降。以上结果表明,Cry 1 Ac蛋白对棉铃虫齿唇姬蜂的个体发育过程,特别是生殖发育产生了抑制作用,表现出明显的不亲和效应,这也预示着田间环境中的某些毒物可能对棉铃虫齿唇姬蜂的卵巢发育产生了致畸作用。四、Cry 1Ac毒蛋白对棉铃虫齿唇姬蜂解毒酶P450基因的影响细胞色素P450是昆虫重要的解毒酶,参与有毒物质的代谢,田间棉铃虫齿唇姬蜂卵巢发育异常可能是受到有毒物质的影响,而研究解毒酶P450基因的变化,则可验证该假设。基于转录组数据,筛选出2个P450基因,分别是CYP6A2和CYP307A1。通过荧光定量PCR法对田间棉铃虫齿唇姬蜂卵巢发育异常转录组样本的P450基因的表达量进行检测,发现这2个解毒酶基因的表达量均显著低于卵巢发育正常的。同时发现,这2个P450基因表达与性别相关,即仅雌蜂特异表达,是否是雌性特异基因还有待进一步研究,特别是它们与卵巢发育的相关性将是今后深入探究的重点。此外,这2个P450基因表达水平还呈现明显的地域性差异。采自许昌和原阳两地蜂的P450的表达量显著要低,这可能与不同地区的施药水平、环境因素相关。进一步,检测经Cry 1Ac毒蛋白饲喂被寄生棉铃虫育出的棉铃虫齿唇姬蜂的CYP6A2和CYP307A1的表达量,发现都显著上升,说明Cry 1Ac毒蛋白诱导了解毒酶P450基因的上调,这意味着它们参与了对毒蛋白的解毒作用。