论文部分内容阅读
香鱼(Plecoglossus altivelis)为一种集约化养殖的名贵鱼类,养殖前景广阔。实践中发现香鱼性成熟后雌雄个体之间存在性别生长相关二态性(sexual size dimorphism),雌鱼销售价格比雌雄混合销售高出一倍以上。为提高香鱼养殖效益,采用染色体操作技术研究香鱼的雌核发育,采用AFLP分子标记技术筛选获得一条雄性性别特异性标记并转化为SCAR标记,采用转录组测序技术(RNA-seq)研究分析了繁殖季节相关基因在性腺中的表达,进一步采用RT-PCR分析了性腺发育相关基因(foxl2、dax1、tra2和vasa)在成鱼组织中的表达。结果如下: 香鱼雌核发育诱导以静水压法最佳,15日龄子代存活率为(15.2±8.2)%。SSR标记分析表明静水压法可以通过抑制第二极体排出诱导香鱼雌核发育,雌核发育子代比例为87.5%。SRAP标记K-group引物组合在母本中扩增出母本特有条带4条,父本特有条带3条,子代样本条带分布状况基本符合孟德尔定律;P-group引物组合在母本中仅能扩增出1条带,无特异性,父本扩增出特有条带7条。No.7和No.14样本检测到父本特有条带,属于非雌核发育子代鱼苗。与微卫星标记相比,SRAP标记可通过一次反应可同时实现对香鱼基因组多个位点检测,获得更多的遗传信息。 香鱼性别相关标记筛选结果表明:63对AFLP选择引物扩增出3733条清晰条带,平均每组引物获得清晰带59条。其中E-ATG/M-CTG引物组合扩增出一条大小为139bp的雄性特异性条带,转化为SCAR标记后命名为ayu102。12尾野生香鱼检测发现总计发现6条扩增片段,其中5个片段(分别命名为:a、b、c、d和e)只在雄性个体中扩增获得;一条片段(命名为:f)在雌雄个体均出现,片段e和f序列同源性为96.67%。ayu102性别标记有效性检测采用45日龄养殖群体、野生群体和雌核发育群体。结果显示片段e出现于所有的雄性个体中,养殖雌性群体出现片段e的频率为6.7%。表明ayu102标记可用于香鱼性别鉴定研究,并对揭示香鱼性别决定系统具有重要的意义。 香鱼繁殖季节性腺转录组测序总共获得46829个unigene,精巢、卵巢分别获得43125、46455个unigene。功能注释获得5348个GO items,1053个酶和279个KEGG途径,共有2846个基因注释到24个COG分类中。精巢、卵巢间存在大量差异表达基因。精巢高表达基因83个,除核糖体相关基因外,RPKM最高的前10个基因分别是微管蛋白、延伸因子-1、早期内体抗原1、冷诱导rRNA结合蛋白、肌酸激酶、肽酰脯氨酰异构酶、热激蛋白70kDa、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白、增殖细胞核抗原基因、热激蛋白90。卵巢高表达基因42个,RPKM最高的前10个基因分别为N-myc原癌基因、NAD(P)H脱氢酶、脂肪酸结合蛋白、微管蛋白、组蛋白H2A、延伸因子1、细胞周期蛋白A/B、热激蛋白70kDa、核转运蛋白、核糖体蛋白。精巢差异基因主要与细胞内物质运输、蛋白质转录翻译、精子形成、脂肪酸代谢等相关;卵巢差异表达基因主要与信号传导、膜泡运输、类固醇激素代谢、脂肪酸代谢、介导免疫应答等相关。 香鱼dax1基因cDNA长度为1150 bp,编码266个氨基酸,与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高为62%;tra2基因 cDNA长度为1821 bp,编码320个氨基酸,与慈鲷(Pundamilia nyererei)的同源性最高为77.8%;foxl2基因cDNA长度为2290 bp,编码305个氨基酸,与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的同源性最高为94.7%;vasa基因cDNA长度为6099bp,编码612个氨基酸,与大西洋鲑(Salmo salar)的同源性最高为74.3%。dax1基因表达模式存在性别相关二态性,在肌肉中表达水平最高。tra2基因在各组织中均能检测到表达信号,雌雄组织表达量无显著差异。foxl2基因的表达模式存在显著性别相关二态性,主要在在雌性卵巢、心脏和肌肉组织中表达。vasa基因在精巢中表达量显著高于卵巢,除肝脏组织外,其他组织均能检测到该基因表达信号。dax1和foxl2基因在卵巢中表达,精巢中不表达,可能与卵巢发育有关;tra2和vasa基因在性腺中表达水平较高,可能与性腺功能维持有关,上述基因在香鱼性腺发育过程中的具体作用尚待做进一步研究。 上述研究结果为香鱼良种选育、性腺发育调控机制揭示等方面提供了基础资料。