肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下局部组织细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致异常增殖而形成的新生物,可以发生于人体的大多数组织器官。传统的治疗手段包括外科手术、化疗、放疗等,虽然可能在很大程度上抑制了肿瘤的生长,但却仍有明显的缺陷:一方面,这些方法尚难以保证能将机体内所有的肿瘤细胞清除殆尽,故肿瘤复发成为了临床上棘手的问题;另一方面,患者在反复治疗的过程中产生的耐药问题严重影响了常规治疗的效果。因此,如何更好的阐明肿瘤的发生发展机制,从而寻找更有效的肿瘤治疗的靶点一直是肿瘤研究的热点问题。巨噬细胞作为经典的天然免疫细胞,存在于机体的所有组织当中,在机体稳态维持、病原体防御以及组织损伤修复等许多生理病理过程起到了至关重要的作用。它具有很强的可塑性和显著的功能多样性。巨噬细胞依据功能状态的不同可分为经典活化型巨噬细胞(M1型巨噬细胞)与替代活化型巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。M1型巨噬细胞可以通过Th1细胞应答促进炎症、杀伤肿瘤细胞,但是其产生的炎性因子IL-6、TNF-α可通过JAK/STAT3和NF-κB等信号途径促进细胞增殖而促进肿瘤生长。M2型巨噬细胞通过Th2细胞应答发挥对抗炎症、组织修复、免疫调节作用,还可通过分泌EGF、VEGF等影响细胞增殖、促进新生血管形成,从而影响肿瘤的生长、侵袭、转移。巨噬细胞除了依据功能状态的不同而发挥不同作用以外,还可能由于其来源的不同在肿瘤中发挥不同的调控作用。最新的研究表明机体绝大多数的组织定居巨噬细胞都是来自于卵黄囊/胚胎时期的造血干细胞,而非人们传统观念中所认为的成体骨髓单核细胞,并且这些组织定居巨噬细胞可以完全依赖自我增殖来更新。目前,组织定居巨噬细胞和成体骨髓单核细胞分化的巨噬细胞对各类疾病的贡献及调控机制是巨噬细胞研究领域的热点问题。特别的,在肿瘤中的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophags,TAMs)的来源、分化调控机制尚不清楚。TAMs存在于所有实体肿瘤中,是浸润肿瘤的主要免疫细胞亚群之一。近年来,大量的研究证实巨噬细胞以多种方式参与了在肿瘤的发生发展过程。肿瘤相关巨噬细胞可以基于激活模式的不同(M1型和M2型巨噬细胞)而对肿瘤产生不同效应,并且影响肿瘤组织的各个方面,包括干细胞、血管生成、侵袭、转移等。临床研究显示多数的人类肿瘤中TAMs的增多与患者较差的预后密切相关。反之,肿瘤细胞又可以通过多种方式影响肿瘤微环境,从而改变巨噬细胞的表型,促使TAMs向免疫抑制型转变,促进肿瘤自身生长。由于巨噬细胞具有较强的可塑性,TAMs对于肿瘤生长发挥促进还是抑制作用尚有争议。尽管如此,利用巨噬细胞的可塑性,操控巨噬细胞的激活模式去除有害效应、放大有利效应,从而达到治疗恶性肿瘤如肝癌、肺癌的干预理念与措施,已经引起研究人员的广泛关注。但是目前肿瘤相关巨噬细胞分化以及功能的精确调控机制尚不完全清楚,在很大程度上制约了新的治疗技术与方法的发展,因而深入理解调控肿瘤相关巨噬细胞的分子机制是有效进行肿瘤免疫学治疗的前提。Notch信号是一条调控细胞分化与发育高度保守的信号通路。当相邻细胞的Notch受体、配体相互接触时,γ-分泌酶(γ-secretase)催化裂解形成Notch胞内段(Notch intracellular domain,NIC)。之后NIC进入细胞核内结合并激活转录因子RBP-Jk(recombination signal-binding protein Jk),调控分化相关基因Hes和Hey分子的转录,从而调节细胞的分化、发育、增殖、凋亡等过程。以往的研究发现Notch信号通路不仅在T、B淋巴细胞的分化上起决定性作用,而且在单核细胞向巨噬细胞或DC分化的方向选择中也具有重要意义。我们课题组通过前期研究发现:Notch信号通路可以通过调节巨噬细胞的极化状态从而影响其在实体肿瘤中发挥的功能。然而,Notch信号通路在体内是如何调控肿瘤相关巨噬细胞分化及功能,以及对应的分子机制都尚不清楚。由于皮下部位组织定居巨噬细胞可能相对较少,可以体现从骨髓动员的单核细胞对TAM的贡献,而肝脏组织定居巨噬细胞(即Kupffer细胞)非常丰富,占机体组织定居巨噬细胞的80%-90%,可以较好的反映组织定居巨噬细胞对TAM的贡献。所以本课题研究利用巨噬细胞特异性Notch通路缺陷的Lyz2creRBPJ-/-小鼠(KO小鼠)及对照野生型小鼠(WT小鼠)构建皮下接种的肺癌模型(TAMs主要来源于骨髓单核细胞)与肝脏原位接种的肝癌模型(TAMs可能由骨髓单核细胞或组织定居型Kupffer细胞贡献)两种模型以阐述Notch信号通路对不同来源肿瘤相关巨噬细胞分化及功能的调控及其对肿瘤进展的影响。主要研究结果如下:1.皮下肺癌模型(1)肿瘤表型:连续测量肿瘤大小观察到KO鼠皮下肺癌的生长比WT鼠减慢,剥离肿瘤后,发现KO鼠皮下肺癌体积及重量都小于WT小鼠。(2)肿瘤组织病理学变化:石蜡切片HE染色以及对CD31的免疫荧光染色提示KO鼠肺癌组织内血管样结构的密度明显低于WT鼠,其病理学变化与KO鼠肿瘤减小的表型变化一致。(3)巨噬细胞表型:流式分析及免疫荧光染色提示KO小鼠肺癌组织内TAMs显著少于WT小鼠。(4)巨噬细胞功能表型:①q-PCR实验显示:与WT鼠相比,KO鼠肺癌组织内M2型极化分子标志IL-10、Ym-1、Arg-1的表达下调,而M1型极化分子标志IL-1β上调。ELISA实验显示KO鼠皮下肺癌模型血清中IL-10水平显著低于WT鼠,进一步证实q-PCR结果。②流式细胞术分析表明两组肿瘤内T、B淋巴细胞数目之间的比较无显著差异。(5)TAMs减少的机制探讨:①TAM分化状况:流式分析结果显示KO鼠肿瘤、脾脏、骨髓中F4/80intCD11bhi单核前体细胞中Ly6c+细胞比例高于WT小鼠,提示其向巨噬细胞的分化可能受阻。②TAM的增殖情况:以免疫荧光染色对F4/80与Ki67进行共染,结果显示KO小鼠肺癌组织中TAMs的增殖能力比WT鼠降低。KO小鼠肿瘤组织中巨噬细胞增殖相关因子CSF1、CSF2表达均下调。③TAM的趋化状况:KO小鼠肿瘤组织中趋化因子CCL7、内皮细胞受体VEGFR1表达均下调。2.原位肝癌模型(1)肿瘤表型:剥离小鼠肝癌包块,发现KO鼠原位肝癌肿瘤体积及重量都大于WT小鼠。(2)肿瘤组织病理学变化:石蜡切片HE染色以及对CD31的免疫荧光染色提示KO小鼠原位肝癌组织内血管样结构的密度明显高于WT小鼠。(3)巨噬细胞表型:流式分析及免疫荧光染色提示KO小鼠原位肝癌组织内TAMs显著多于WT小鼠。(4)巨噬细胞功能表型:①q-PCR实验显示:与WT鼠相比,KO鼠肝癌组织内M2型极化分子标志IL10、Ym-1的表达上调,而M1型极化分子标志IL-1β下调。ELISA实验显示KO鼠原位肝癌模型血清中IL-10水平明显高于WT鼠,与q-PCR结果一致。②流式分析表明KO小鼠肝癌组织中CD8+T细胞数目少于野生小鼠,癌旁组织中CD4+T细胞少于WT鼠,这与肿瘤增大的表型一致;KO小鼠血液CD4+T细胞多于WT鼠,提示可能是由于肿瘤增大导致外周参与适应性免疫反应的淋巴细胞募集增多。(5)TAMs增多的机制探讨:①TAM分化状况:流式分析结果显示KO小鼠肝癌组织中F4/80intCD11bhi单核前体细胞中Ly6c+细胞比例高于WT小鼠,与皮下LLC模型一致,提示其仍可能存在分化受阻,但癌旁组织、脾脏中并没有见到同样变化,骨髓中F4/80intCD11bhi细胞中Ly6c+细胞所占比例反而低于WT鼠。②TAM增殖状况:对F4/80和Ki67的免疫荧光染色结果显示KO小鼠肝癌组织中TAMs的增殖能力与WT鼠相比升高。但是KO小鼠肿瘤组织中巨噬细胞增殖相关因子CSF1表达下调,CSF2无明显差异,提示KO鼠原位肝癌TAMs增殖能力的上升可能是其他增殖相关因子变化导致的,比如IL-4等。③TAM的趋化状况:KO小鼠肿瘤组织中趋化因子CCL9、内皮细胞受体VEGFR1表达均上调。3.原位肝癌模型TAMs的来源由于皮下肺癌模型与原位肝癌模型的表型变化截然相反,我们推测原位肝癌模型中TAMs可能不同于皮下肺癌模型造成其受Notch信号调控的不同。我们构建骨髓重建小鼠原位肝癌模型,结果显示原位肝癌中TAMs只有约20%为GFP阳性,这提示着绝大多数TAMs并非来自于骨髓单核细胞,而可能是组织定居Kupffer细胞。通过以上实验结果可以得到以下结论:1.小鼠皮下肺癌模型中特异性剔除巨噬细胞RBPJ抑制肺癌的进展,而小鼠原位肝癌特异性剔除巨噬细胞RBPJ促进肝癌的进展,由此可知:特异性阻断巨噬细胞Notch信号通路对不同部位接种肿瘤的生长影响不同。2.皮下肺癌模型TAMs可能主要来源于骨髓单核细胞,而单核细胞在Notch通路阻断时,向TAMs分化受阻,导致TAMs减少。对应的,肿瘤组织中M1型极化分子表达升高,M2型极化分子表达降低,新生血管形成减小,这些共同导致肿瘤减小;而MΦ增殖因子分泌减少导致TAMs增殖能力下降,可进一步导致TAMs减少。而原位肝癌模型TAMs可能主要来自组织定居Kupffer细胞的原位增殖,而非骨髓单核细胞。虽然Notch通路阻断可导致单核细胞分化受阻,但是Kupffer细胞的原位增殖不依赖于Notch通路而且在Notch阻断的情况下增殖能力上升(依赖于M-CSF、GM-CSF以外的因子),最终导致TAMs增加。对应的,肿瘤组织中M1型极化分子表达降低,M2型极化分子表达增加,新生血管形成增加,这些共同导致肿瘤增大。综上,本研究工作详细的阐明了皮下LLC肿瘤模型及原位肝癌模型中巨噬细胞Notch通路阻断对于肿瘤组织病理学、免疫微环境以及巨噬细胞自身功能的影响,并且发现除了招募的骨髓单核细胞,组织定居型巨噬细胞也可以成为TAMs的来源,而且发现单核细胞向TAMs的分化依赖于Notch信号,但Kupffer细胞增殖成为TAMs不依赖于Notch信号。