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肝癌的侵袭转移是一个多步骤、多环节共同参与的高度选择性、非随机的过程，涉及到肿瘤细胞间及肿瘤细胞与宿主组织微环境间复杂的相互作用。肿瘤细胞突破宿主细胞和间质屏障，获得侵袭转移能力的前提是靶向黏附。CD44分子是细胞表面的整合膜蛋白，属黏附分子家族，主要参与肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的异质性粘附，使肿瘤细胞得以脱离与周围细胞的粘附而发生浸润或转移，在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用，即直接参与肿瘤的进展和转移过程。细胞表面糖链对于细胞内外的物质交换、细胞间的信息的转换与交流和细胞间的通讯起着重要的作用。到目前为止，国内外尚无针对在人肝细胞肝癌侵袭转移过程中CD44S及其变异体CD44v糖基化改变的研究报道。本研究选定CD44S及其变异体CD44v分子作为研究的切入点，从蛋白表达及糖基化两个层面，探索CD44，尤其是CD44v6与肝癌细胞侵袭转移的关系，结果将为黏附分子参与肝癌侵袭转移的内在机制提供新的理论基础。 第一部分转移及非转移性肝癌组织或血清中CD44S及其变异体CD44v的表达 本部分的研究是构建组织芯片，利用半定量免疫组织化学完成CD44S及其变异体CD44v的定位分析，并采用量子点对转移与非转移性肝癌组织中CD44S及其变异体CD44v的表达进行定量分析;采用ELISA法检测转移与非转移性肝癌患者血清中CD44v6水平差异。 免疫组化结果显示，CD44S蛋白表达以细胞浆为主;CD44v3、CD44v4/5蛋白在肝癌细胞膜与细胞浆均有表达;而CD44v6以细胞膜表达为主。这些蛋白在肝癌组织中均广泛表达，偶见局灶性或散在表达。上述指标中，只有转移组CD44v6表达高于非转移肝癌组织，差异有统计学意义(P=0.032，x2=8.284);同时量子点结果显示，CD44v6蛋白在转移性肝癌组织中的信号强度值为33312±102;而在非转移性肝癌组织中只有9620±135，两者具有显著差异(P=0.024)。此外，转移性肝癌患者血清中CD44v6含量(3.80±0.57ng/ml)明显高于非转移肝癌患者血清(2.64±0.32ng/ml)，两组差异具有显著性(P＜0.05)。 第二部分 CD44S及CD44v在转移潜能不同肝癌细胞中的表达 本部分的研究目的是利用细胞免疫荧光技术、western blot和RT-PCR，对不同转移潜能人肝细胞肝癌细胞系Hep3B、MHCC97L、MHCC97H中CD44S及其变异体CD44v3、CD44v4/5、CD44v6的表达进行检测。此外，应用甲基化特异PCR(MSP)技术，对Hep3B、MHCC97L、MHCC97H中CD44v6基因启动子的甲基化进行分析。 免疫细胞荧光检测结果显示，CD44S主要定位在肝癌细胞胞浆及胞膜上，而CD44v6则多分布在细胞膜，亦可见于细胞浆。在Western blot结果中，CD44v6蛋白在3种肝癌细胞系Hep3B、MHCC97L、MHCC97H中与相应内参GAPDH的条带光密度比值依次为:0.21±0.03、0.42±0.08、0.91±0.06，转移潜能最强的MHCC97H表达最高，且与转移潜能一致。而CD44S、CD44v3、CD44v4/5表达水平并不随转移潜能升高而增高。RT-PCR结果显示，在有转移潜能的2个细胞系中CD44v6 mRNA的表达均比无转移潜能的细胞系Hep3B显著增加，转移潜能最强的MHCC97H表达最高，且与转移潜能一致。此外，CD44v6基因启动子在MHCC97L及MHCC97H肝癌细胞中发生不完全甲基化，而Hep3B细胞中则发生完全甲基化。 第三部分CD44v6的糖基化与肝癌细胞转移潜能的相关性研究 在癌症发生和发展的过程中，蛋白质的糖基化修饰及表达水平会发生改变。本部分的研究目的就是探讨在人肝细胞肝癌细胞系中CD44v6糖基化与转移潜能的关系，并进一步明确其参与肝癌侵袭转移的内在联系。 经免疫沉淀方法将Hep3B、MHCC97L及MHCC97H肝癌细胞中CD44v6成功沉淀下来，并利用western blot证实。凝集素印迹结果显示，在MHCC97L与MHCC97H中CD44v6蛋白对MAL、SNA及WGA的亲和力较Hep3B高，而对AAL、ConA、DSA及LCA的亲和力与Hep3B并无明显差异。 结论 1.在CD44S及其变异体CD44v中，CD44v6蛋白的高表达与肝癌转移潜能的增强呈正相关。 2.CD44v6高表达与肝癌细胞转移潜能升高一致，可能与其启动子甲基化水平有关。 3.CD44v6蛋白唾液酸寡糖链的增加有助于提高肝癌细胞转移潜能。潜在应用价值 1.探讨了CD44v6蛋白糖基化与肝癌转移的关系，有助于肝癌病理机制的阐明，为肝癌的干预治疗研究提供新的靶点。 2.CD44v6可能作为一种潜在的、有应用价值的测定肝癌转移的标志物。 创新点 首次发现了CD44v6蛋白唾液酸寡糖链的增加与肝癌细胞转移潜能增高的关系。