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目的：观察血吸虫感染对原代肝星状细胞(HSC)向纤维化表型转化的影响。方法：1)建立血吸虫肝纤维化模型,利用腹部尾蚴敷贴法建立血吸虫肝纤维化模型,应用HE染色和Masson染色方法观察和鉴定血吸虫肝纤维化的形成。2)提取原代肝星状细胞,应用两步酶消化联合非连续梯度密度离心法分离提取原代HSC3)应用免疫荧光方法标记α-SMA对提取的原代HSC进行鉴定,并比较正常组与模型组提取的HSC内α-SMA表达量的差别。4)应用RT-Real-time PCR技术检测原代肝星状细胞内α-SMA和desmin基因转录水平,并且比较正常组提取的原代肝星状细胞与肝纤维化模型组提取的原代肝星状细胞之间的差异。5)应用免疫印迹(Western blot)方法检测原代肝星状细胞内α-SMA和desmin蛋白表达水平,并且比较正常组提取的原代肝星状细胞与肝纤维化模型组提取的原代肝星状细胞之间的差异。同时利用免疫印迹法比较正常组原代HSC与模型组HSC内各种肝纤维化指标的变化,以及血吸虫虫卵抗原刺激前后HSC内各种肝纤维化指标的变化。结果：1)血吸虫感染小鼠六周后,取小鼠肝脏组织做病理检测,由HE染色显示,在感染血吸虫小鼠的肝脏组织内可发现虫卵沉积在血管内,以虫卵为中心出现类圆形的嗜酸性肉芽肿,内有炎症细胞浸润,Masson染色显示蓝色的胶原纤维在肝脏组织内围绕着虫卵性肉芽肿呈同心圆状沉积。正常组小鼠与肝纤维化模型组小鼠有显著性差异。2) α-SMA免疫荧光染色发现,分离的HSC纯度为95%,由模型组提取的原代肝星状细胞内的α-SMA的表达量明显高于正常组。同时以平滑肌细胞和足突状细胞作为α-SMA和desmin蛋白表达的阳性对照,通过免疫印迹检测我们发现我们提取的原代肝星状细胞内均表达这两种标志性蛋白,表明提取的原代细胞为肝星状细胞。3)小鼠体内感染血吸虫感染后对HSC内α-SMA和desmin表达量的影响：RT Real TimePCR方法检测显示在血吸虫性肝纤维化化小鼠提取的原代肝星状细胞内α-SMA和desmin的mRNA表达水平明显高于正常组小鼠提取的原代肝星状细胞内的水平。免疫印迹法同样显示模型组提取的的原代肝星状细胞内α-SMA和desmin的蛋白表达水平明显高于正常组小鼠原代肝星状细胞,且有统计学差异(P<0.05)。4)小鼠体内感染血吸虫感染后对HSC内一型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)和基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue Metallopeptidase Inhibitor1, TIMP-1)表达量的影响：免疫印迹法显示由模型组提取的原代肝星状细胞内Collagen Ⅰ和基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1的蛋白表达水平明显高于正常对照组提取的原代肝星状细胞内的水平且有统计学差异(P<0.05)。5)体外血吸虫虫卵抗原(schistosoma soluble egg antigen, SEA)刺激对HSC内一型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)和基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue Metallopeptidase Inhibitor1, TIMP-1)表达量的影响：SEA处理由正常组提取的原代肝星状细胞后,利用免疫印迹法检测肝星状细胞内的Collagen Ⅰ和TIMP-1明显高于对照组细胞内的表达水平。RT Real Time PCR方法检测SEA处理HSC后Collagen Ⅰ和TIMP-1的mRNA表达水平也明显增加且有统计学差异(P<0.05)。结论利用血吸虫尾蚴腹部敷贴法成功建立血吸虫肝纤维化小鼠模型,并提取和鉴定由正常小鼠和肝纤维化小鼠提取的肝星状细胞。慢性血吸虫感染以及急性虫卵抗原刺激均可导致肝星状细胞的激活以及向肝纤维化表型的转化。目的：观察血吸虫肝纤维化小鼠肝脏内CB1和CB2的变化以及体外SEA刺激后对HSC内CB1和CB2的影响,同时研究CB1和CB2在纤维化中的作用。方法1)Real time RT-PCR检测RNA水平,肝纤维化模型组的原代HSC与正常组HSC细胞内CB1和CB2表达量的变化。同时检测血吸虫虫卵抗原刺激HSC后对CB1和CB2表达量的影响。2) Western-blotting检测蛋白水平肝纤维化模型组的原代HSC与正常组HSC细胞内CB1和CB2,CollagenⅠ和TIMP-1表达量的变化。同时检测血吸虫虫卵抗原刺激HSC后对CB1CB2、CollagenⅠ和TIMP-1表达量的影响。3)利用转染siRNACB1方法抑制CB1表达后检测SEA处理HSC内CollagenⅠ和TIMP-1表达量的变化。结果1)在RNA和蛋白水平,正常组HSC相比,血吸虫肝纤维化模型组小鼠HSC细胞内CB1的表达明显增加(P<0.05),但对CB2的表达无影响。2)在RNA和蛋白水平,可溶性血吸虫抗原时可明显促进CB1的表达(P<0.05),而CB2的表达没有明显的影响。3)HSC转染siRNACB1后检测CB1在RNA和蛋白水平均被抑制,且抑制率为80%左右。且通过检测CB1调节的下游信号通道及P-AKT的表达检测CB1被抑制后其功能同样被抑制,本实验表明HSC转染siRNACB1后P-AKT的表达明显下降(P<0.05)。4)HSC转染siRNACB1后,可抑制SEA对α-SMA, CollagenⅠ和TIMP-1表达量的增加,且有统计学差异(P<0.05)。5)DPI处理HSC后可抑制SEA对α-SMA, CollagenⅠ和TIMP-1蛋白水平的表达,且有统计学差异(P<0.05)。6)siRNANox1和siRNANox4转染HSC后同样可抑制SEA对α-SMA,CollagenⅠ和TIMP-1蛋白水平的表达,且有统计学差异(P<0.05)。结论CB1在血吸虫肝纤维化的形成中发挥着重要作用。目的：探讨NADPH Oxidase是否介导了SEA对CB1表达量的调节作用及其相关作用机制方法：1)建立血吸虫肝纤维化模型,利用腹部尾蚴敷贴法建立血吸虫肝纤维化模型,将所有小鼠分为三组正常对照组,血吸虫性肝纤维化模型组和腹腔注射DPI (NADPH oxidase的抑制剂)的血吸虫肝纤维化治疗组,治疗组主要为感染血吸虫后按照1g/kg/24h/只的剂量使用至血吸虫肝纤维化形成即7周为止,7周后取小鼠肝脏组织,应用HE染色和Masson染色方法观察和鉴定血吸虫肝纤维化的形成以及DPI是否有降低肝纤维化的作用。2)应用免疫印迹(Western blot)方法在蛋白水平检测三组小鼠肝脏组织内CB1表达量的变化,以及在原代肝星状细胞内NADPH oxidase的三个亚基(Nox1, Nox2,Nox4)对CB1的影响,以及CB1对上述三个亚基的影响,并且探讨较Noxl和Nox4对原代肝星状细胞纤维化功能的影响即对α-SMA, Collagen Ⅰ和TIMP-1的影响。其他相关蛋白表达量的变化均用免疫印迹方法进行检测。3)利用电子自旋共振(Electron Spin Resonance, ESR)技术检测模型组小鼠HSC与正常组小鼠HSC内生成超氧化物的差异,以及SEA刺激HSC后是否会促进超氧化物的产生,同时检测Nox1、Nox4和CB1分别对超氧化物生成的影响4)利用siRNA转染技术将siRNANox1、siRNANox4和siRNANrf2分别转染HSC内,同时利用核转染技术将shRNANox2转染入HSC内,分别抑制Nox1,Nox2,Nox4和Nrf2的表达后对CB1和HSC纤维化功能的影响。5)提取核蛋白并检测转录因子Nrf2的转录活性6)应用免疫荧光方法标记Nrf2检测在SEA刺激后Nrf2是否会发生核转移,以及Nox1和Nox4被抑制后对Nrf2和转移的影响。结果：1)建立血吸虫肝纤维化模型,并在造模的同时给予DPI药物治疗,通过HE染色和Masson染色发现。DPI用药组小鼠的纤维化程度明显低于肝纤维化模型对照组。利用image plot6软件统计分析胶原纤维的含量,模型组明显高于正常对照组,而DPI用药组低于模型组,且具有统计学差异(P<0.05)。2)利用电子自选共振技术我们检测到肝纤维化小鼠的HSC内产生的超氧化物明显高于正常对照组小鼠HSC,并且当SEA刺激HSC后超氧化物生成增加。我们还发现当Noxl和Nox4的表达被siRNA抑制后SEA刺激HSC后其内超氧化物的生成量明显下降,但CB1的表达被抑制后则不影响SEA对HSC生成超氧化物。利用DPI处理细胞后同样可以抑制SEA对HSC内超氧化物的生成。3)利用免疫印迹方法检测我们发现Noxl和Nox4被抑制的同时也抑制了SEA对HSC内CB1的表达,而Nox2被抑制后则不会影响SEA对HSC内CB1表达量的变化。利用DPI处理细胞后同样可以抑制SEA对HSC内CB1表达量的增加。4)利用免疫印迹方法观察Noxl, Nox4和CB1之间是否存在相互影响的关系,我们发现当Noxl被抑制后同时Nox4的表达量也会降低,而当Nox4被抑制后对Nox1则没有影响,同时我们还发现CB1被抑制后,Noxl, Nox4的表达量没有受到影响。5)由免疫荧光方法我们检测到当SEA处理HSC后Nrf2可有细胞浆转移至细胞核内,而当Noxl和Nox4被抑制后核转移现象则会被抑制。6)提取核蛋白检测转录因子Nrf2的转录活性,结果表明SEA刺激HSC后Nrf2的转录活性明显增减,但当Noxl和Nox4被抑制的同时也抑制了SEA能够增强Nrf2转录活性的作用。7)SEA可促进Nrf2的蛋白表达量,当Nrf2被抑制后,可抑制SEA对CB1表达量的影响。8)利用免疫印迹方法检测我们发现Noxl和Nox4被抑制的同时也抑制了SEA对HSC内各种纤维化指标如α-SMA, Collagen Ⅰ和TIMP-1表达量的变化。利用DPI处理细胞后同样可以抑制SEA对HSC内各种纤维化指标如α-SMA, Collagen Ⅰ和TIMP-1表达量的变化。结论：血吸虫感染和SEA刺激均可显著上调CB1受体在小鼠原代肝星状细胞的表达,并且CB1受体的上调是依赖于由Noxl和Nox4介导所产生的超氧化物的作用。由于CB1的上调,导致肝星状细胞向纤维化表型转化。肝星状细胞内的Nox-介导的氧化还原信号可以作为血吸虫病预防或治疗肝硬化的一种新的治疗靶点。