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目前工业上广泛应用的腺苷酸脱氨酶(AMP deaminase，EC3.5.4.6)最早是由哺乳类动物细胞制备，如人红血细胞、鼠骨骼肌细胞等。现在工业生产中通常由酵母、曲霉、毛霉等微生物直接发酵来制备AMP脱氨酶，包括固态发酵法和液态发酵法，但是该方法在酶的活性、稳定性等方面存在很多问题。因此，利用基因重组技术将微生物来源的AMP脱氨酶基因在特定宿主中进行重组表达，可以有效改善上述问题。所以，本实验通过分子生物学方法获得蜂蜜曲霉、米曲霉以及鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因，拟在不同宿主中实现AMP脱氨酶基因的重组表达，对重组菌的摇瓶发酵条件进行初步优化，以期获得较高的酶活，并对重组蛋白进行纯化以及酶学性质研究。以蜂蜜曲霉RNA为模板反转录获得cDNA，利用简并引物PCR扩增出中间保守序列，通过RACE技术扩增出该基因的3′末端和5′末端序列，根据Vector NTI软件和Kozak规则寻找到该基因的开放阅读框(ORF)，该ORF由2082bp碱基组成。然后，设计引物PCR扩增出该基因，命名为AMPDa，纯化后与pEASY-T1载体相连，获得克隆载体pEASY-T1-AMPDa。以米曲霉RNA为模板反转录获得cDNA，PCR扩增出米曲霉AMP脱氨酶基因，命名为AMPDb，与pEASY-T1载体相连，获得克隆载体pEASY-T1-AMPDb。以鼠灰链霉菌染色体基因组为模板PCR扩增出编码AMP脱氨酶的成熟肽基因AMPDc1以及全基因AMPDc2，与pMD19-T Simple Vector相连，获得克隆载体pMD19-T-AMPDc1和pMD19-T-AMPDc2。分别构建重组表达载体pET28a-AMPDa、pET28a-AMPDb和pET28a-AMPDc1，转化大肠杆菌获得相应的重组菌株。酶活测定结果显示，鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因在大肠杆菌中的酶活较高，为150U·mL-1。分别构建重组表达载体pHY-p43-AMPDc2、pGAP9K-AMPDc1和pKLAC1-AMPDc1，转化枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母，得到相应的重组菌株。酶活测定结果显示，重组枯草芽孢杆菌和重组乳酸克鲁维酵母的酶活相对较低，重组毕赤酵母菌株的酶活较高，为800U·mL-1。对重组毕赤酵母菌的摇瓶发酵条件进行优化，结果表明，该重组菌的最适发酵培养基为：甘油2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O0.05%，pH6.0；发酵条件为：接种龄24h，转接量3%，30℃、200r·min-1。在该条件下摇瓶培养96h，取发酵上清测酶活，重组AMP脱氨酶酶活达到2230±60U·mL-1，是优化前的2.7倍。通过Ni-螯合柱对重组毕赤酵母菌株表达的AMP脱氨酶进行纯化，SDS-PAGE蛋白电泳显示为单一条带。对重组AMP脱氨酶的酶学性质进行研究，结果显示，该重组酶最适反应温度为60℃，最适pH为6.0，在30℃-60℃以及pH5.0-8.0范围内稳定性较好，良好的热稳定性使其在工业应用中具有一定的优势。