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苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)是人体所需的必需氨基酸,在医学、营养学、食品加工及动物饲养领域均有应用。苯丙氨酸还是生产甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)的关键原料,目前市场需求日益增加。我国缺乏先进高效的L-苯丙氨酸(L-Phe)生产技术,主要依靠进口,因此利用分子生物学技术构建L-苯丙氨酸高产工程菌具有现实意义。本研究通过设计、优化酶基因的间隔调控序列(Intergenic regulatory sequence),使L-Phe生物合成代谢通路上下游的关键酶基因pheA、aroF和ppsA协同表达,从而达到提高L-Phe产量:⑴分别设计酶基因pheA、aroF和ppsA的调控序列,构建单基因重组质粒,其中成功构建的重组子pTrc-99a-pheA,pTrc-99a-aroF单基因酶蛋白获得高表达;⑵构建pheA和aroF酶基因串联重组质粒pZE12-AF,改变两个串联基因间隔调控序列后得到了重组子pZE12-RBS-AF,将这两个重组质粒转入营养缺陷菌MG△pheA…aroF中,成功构建了工程菌MG△pZE12-AF和MG△pZE12-RBS-AF;⑶构建三个酶基因pheA、aroF和ppsA串联重组质粒pZE12-AFP,调整ppsA的调控序列后的重组子pZE12-RBS-AFP,并成功构建相应工程菌MG△pZE12-AFP和MG△pZE12-RBS-AFP。利用SDS-PAGE观测酶蛋白表达量,调整多酶基因AF的间隔调控序列,二基因重组质粒pZE12-RBS-AF的酶蛋白比pZE12-AF表达量高;同样,AFP三基因重组质粒中,pZE12-RBS-AFP质粒调整了ppsA的间隔调控序列,酶蛋白比pZE12-AFP表达量也明显增多。测定工程菌发酵培养液上清中L-Phe的含量,MG△pZE12-RBS-AF工程菌L-Phe的产量比MG△pZE12-AF提高了1.5倍;MG△pZE12-RBS-AFP的产量比MG△pZE12-AFP也提高了2倍。MG△pZE12-RBS-AFP菌L-Phe的产量是MG△pZE12-RBS-AF的1.2倍。实现了L-Phe生物合成中关键酶基因pheA、aroF和ppsA协同、匹配表达,代谢流显著流向终产物L-Phe,表明调整串联酶基因的间隔调控序列是改变代谢流及提高L-Phe的产量的一种有效方法。此外,选用低拷贝的pZE12质粒作为表达载体比高拷贝质粒(例如pTrc-99a)酶表达更适度而稳定,并不易形成包涵体和活性更高。