第一章 WT1与多囊卵巢综合征相关性研究研究背景:多囊卵巢综合征(PCOS),是一种常见的生殖内分泌疾病,以高雄激素血症、月经稀发、卵巢呈现多囊样改变为主要临床特征。PCOS临床表现复杂,异质性强,病因至今不清,有研究显示卵泡发育异常可能是PCOS排卵稀发的主要病因,颗粒细胞分化异常能降低其对卵泡刺激素(FSH)敏感性和雌激素的合成,继而影响卵泡发育。前期研究已证实肾母细胞瘤1基因(Wilms Tumor1,WT1)编码的转录因子WT1,与睾丸决定因子可协同作用于胚胎性腺分化时期的睾丸间质细胞,促进睾酮分泌,从而使中肾管分化为男性内生殖器官。在雌性的大鼠、猴和猪中,WT1仅在卵巢窦前卵泡的颗粒细胞中表达。但目前尚无有关WT1与PCOS的研究。研究目的:探究WT1在PCOS患者颗粒细胞中的表达情况,分析其与临床指标的相关性。研究方法:本研究纳入年龄、用药方案匹配的PCOS患者和正常对照女性作为实验组和对照组各102例。采用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中WT1基因mRNA表达量;采用t检验分析两组的临床基线指标;采用spearman相关评估WT1相对表达量与PCOS患者各临床指标的相关性。采用logistics回归分析WT1表达异常是否增加PCOS发病风险。结果:分析临床资料显示,与正常对照组比较,PCOS组体重指数(P<0.01)、窦卵泡计数(P<0.01)、黄体生成素浓度(P<0.01)均高于对照组,而卵泡刺激素浓度(P<0.01)、高密度脂蛋白(P<0.01)均低于对照组。与正常对照组比较显示,WT1在PCOS实验组中的表达显著增加(表达倍数为2倍,P<0.05)。Spearman分析显示WT1分别与血睾酮、血黄体生成素、双侧窦卵泡计数呈中等相关(r=0.334,P=0.001;r=0.357,P=0.001;r=0.337,P=0.001)。逻辑回归分析结果显示,WT1 增加 PCOS 患病风险:(OR=1.46,95%CI[1.12～1.92],P=0.006),校正BMI 后:(OR=1.388,95%CI[1.07～1.80],Padjusted=0.014)。结论:WT1在多囊卵巢综合征患者的颗粒细胞中高表达且增加PCOS的患病风险。第二章Tox3可通过Wt1影响雌激素合成研究背景:课题组前期发现TOX3是PCOS易感基因之一,其编码钙离子依赖性转录因子TOX3。在结构上,TOX3由N端的一个核定位信号,一个高迁移率组盒区域和C端多聚甘氨酸构成,高迁移组盒区域结合到DNA区域可以改变染色体结构。在兔神经元内与钙离子结合蛋白(CBP)形成复合体相互作用来调节CRE介导的转录。前期利用表达谱芯片研究发现TOX3过表达后WT1上调,而WT1在PCOS患者颗粒细胞中高表达且增加PCOS发病风险。患者颗粒细胞为已分化终末细胞无法传代,借用。研究目的:验证Tox3是否通过Wt1表达影响雌激素分泌。研究方法:通过断颈方法处死小鼠获得卵巢,分离原代颗粒细胞。分别构建腺病毒Tox3、Wt1过表达载体并转染小鼠原代颗粒细胞;采用Western blot法检测颗粒细胞中Cyp19和Fshr的表达水平;采用免疫化学法检测细胞培养上清中的雌激素浓度;采用CCK8实验检测细胞的增殖情况;采用Hochest实验检测细胞的凋亡情况。结果:经过Western blot法验证Wt1在Tox3过表达的颗粒细胞中上调。与对照组比较,Wt1过表达组Cyp19和Fshr表达下降;激素测定结果显示,与对照组比较,Wt1过表达组雌激素合成减少;CCK8实验和Hochest实验结果显示,对照组与Wt1过表达组之间细胞增殖情况与凋亡情况无统计学差异。Wt1抑制Cyp19和Fshr的表达,Cyp19和Fshr颗粒细胞的增殖分化密切相关。Wt1过表达的颗粒细胞培养基上清中雌激素浓度降低,Wt1对于颗粒细胞的增殖或凋亡没有明显作用。结论:Tox3可能通过上调Wt1表达抑制颗粒细胞分化进而影响雌激素合成,而非通过抑制细胞增殖途径。