论文部分内容阅读
第一部分 EMX2 基因突变(c.478G＞T)影响癫痫易感性的机制研究
背景
癫痫是神经系统疾病中一种严重危害人类健康的常见病、多发病,遗传因素是癫痫的病因之一.课题组前期应用基因捕获测序技术在全面性发作的癫痫家系中发现了EMX2基因的错义突变(c.478G>T),导致第160号氨基酸由丙氨酸(Ala)变为丝氨酸(Ser)(p.Ala160Ser),该变异可能导致蛋白质功能受到影响.EMX2基因在神经系统发育过程中扮演了非常重要的角色,其突变可能致使神经系统发育紊乱而诱发异常神经网络活动参与癫痫的发生发展.
目的:
探讨EMX2错义突变(c.478G>T)对癫痫易感性的影响及可能机制.
方法:
本研究主要采用分子生物学、原代神经元培养、鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔建立脑内基因转染模型、CRISPR/Cas9技术构建条件性基因敲入小鼠模型、Cre重组酶腺相关病毒海马立体定位注射、戊四氮慢性点燃癫痫行为学筛查以及染色质免疫共沉淀-测序等方法.基因克隆技术分别构建野生型质粒 EMX2 ( 160Ala )和突变型质粒 EMX2(160Ser),通过转染HEK293细胞,免疫荧光检测野生型及突变型EMX2亚细胞定位,放线菌酮实验结合免疫印迹检测野生型及突变型EMX2蛋白降解情况.通过野生型质粒EMX2(160Ala)和突变型质粒EMX2(160Ser)转染原代神经元,观察神经元初级神经突和次级神经突的生长情况.鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔建立小鼠脑内基因转染模型,通过转染目的质粒,观察突变型EMX2对皮层神经元迁移的影响.利用CRISPR/Cas9技术进行Emx2-A161S(CKI/WT)条件性基因敲入小鼠构建,基于Cre/loxP重组酶系统原理在条件性基因敲入小鼠海马区分别注射Cre重组酶腺相关病毒和对照腺相关病毒建立Emx2突变和对照小鼠模型.小鼠腹腔注射阈下剂量戊四氮建立慢性点燃癫痫模型,观察比较突变组小鼠和对照组小鼠在点燃时间段中各个时间点的发作级别.以转染野生型EMX2(160Ala)质粒和突变型EMX2(160Ser)质粒的HEK293细胞为实验对象,借助染色质免疫共沉淀-测序技术,比较EMX2作用的靶基因,并对相应的基因类群进行GO功能富集分析和KEGG pathway富集分析.
结果
相较于野生型EMX2,突变型EMX2的亚细胞定位未发生变化;放线菌酮实验提示野生型和突变型EMX2的蛋白稳定性没有明显差异.EMX2基因突变会影响神经元初级神经突和次级神经突的生长发育,并导致皮层神经元的迁移紊乱.在戊四氮慢性点燃癫痫模型中,与对照组小鼠相比,Emx2突变加速了癫痫发生发展的进程,降低了点燃过程中的生存率.染色质免疫共沉淀-测序提示突变后的EMX2失去了对一系列靶基因的精准调控.
结论
基因突变(c.478G>T)可能影响了EMX2对下游靶基因转录的调控,致使神经元迁移发育障碍从而增加了癫痫易感性.
第二部分 KIF17调节癫痫发作的功能探讨
背景:
癫痫是由多种原因引起的慢性脑功能障碍综合症,癫痫的反复发作会给患者的身体和心理健康带来巨大的双重危害.中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡而导致的大脑神经元异常同步化放电被认为是癫痫的重要机制之一,进一步研究影响这种失衡的分子机制对于探索新的抗癫痫药物靶点是很有必要的.既往研究证实,KIF17在神经系统NMDA受体NR2B亚基的转运和调节中发挥着重要作用,我们推测其可能具有调节癫痫发作的潜在功能.
目的:
探讨干预KIF17对癫痫发作的影响及可能机制.
方法:
本研究主要采用分子生物学、重组慢病毒载体构建及海马立体定位注射、海人酸海马内注射诱导颞叶癫痫动物模型及行为学记录分析、全细胞膜片钳等方法.从课题组前期建立的包含难治性颞叶癫痫患者术后脑组织和脑外伤减压术切除脑组织的脑库中随机抽取癫痫脑组织标本和对照组脑组织标本,通过免疫印迹技术检测KIF17的表达情况.通过海人酸海马内注射诱导颞叶癫痫动物模型,获取海马组织,通过免疫印迹技术检测KIF17的表达情况.构建小鼠Kif17基因过表达和敲减的慢病毒载体以及阴性对照病毒载体,通过立体定位注射慢病毒特异性干预海马组织KIF17表达,观察上调或下调KIF17对海人酸模型行为学的影响.通过无镁人工脑脊液灌流建立体外脑片癫痫模型,借助全细胞膜片钳技术记录并分析海马内干预KIF17表达后各组脑片CA1区锥体神经元的动作电位频率,微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs)以及微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs)的频率和幅值.
结果:
免疫印迹结果提示在癫痫患者术后脑组织中,KIF17的表达水平较对照组显著升高;在癫痫小鼠模型的海马组织中,KIF17的表达水平较对照组显著升高.在海人酸诱导的癫痫动物模型中,行为学观察发现,与对照组相比,上调海马组织中KIF17可以缩短癫痫发作潜伏期并增加发作次数,而下调KIF17可以延长癫痫发作潜伏期并减少发作次数.在体外无镁癫痫脑片模型中,海马CA1区锥体神经元膜片钳记录结果提示,与对照组相比,上调海马组织中KIF17可以增加动作电位频率以及mEPSCs的频率和幅值,下调KIF17可以产生相反的效果.KIF17的过表达或敲减对mIPSCs幅值和频率的影响并没有显著差异.
结论:
干预KIF17可能通过影响兴奋性突触传递而调节癫痫发作.
背景
癫痫是神经系统疾病中一种严重危害人类健康的常见病、多发病,遗传因素是癫痫的病因之一.课题组前期应用基因捕获测序技术在全面性发作的癫痫家系中发现了EMX2基因的错义突变(c.478G>T),导致第160号氨基酸由丙氨酸(Ala)变为丝氨酸(Ser)(p.Ala160Ser),该变异可能导致蛋白质功能受到影响.EMX2基因在神经系统发育过程中扮演了非常重要的角色,其突变可能致使神经系统发育紊乱而诱发异常神经网络活动参与癫痫的发生发展.
目的:
探讨EMX2错义突变(c.478G>T)对癫痫易感性的影响及可能机制.
方法:
本研究主要采用分子生物学、原代神经元培养、鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔建立脑内基因转染模型、CRISPR/Cas9技术构建条件性基因敲入小鼠模型、Cre重组酶腺相关病毒海马立体定位注射、戊四氮慢性点燃癫痫行为学筛查以及染色质免疫共沉淀-测序等方法.基因克隆技术分别构建野生型质粒 EMX2 ( 160Ala )和突变型质粒 EMX2(160Ser),通过转染HEK293细胞,免疫荧光检测野生型及突变型EMX2亚细胞定位,放线菌酮实验结合免疫印迹检测野生型及突变型EMX2蛋白降解情况.通过野生型质粒EMX2(160Ala)和突变型质粒EMX2(160Ser)转染原代神经元,观察神经元初级神经突和次级神经突的生长情况.鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔建立小鼠脑内基因转染模型,通过转染目的质粒,观察突变型EMX2对皮层神经元迁移的影响.利用CRISPR/Cas9技术进行Emx2-A161S(CKI/WT)条件性基因敲入小鼠构建,基于Cre/loxP重组酶系统原理在条件性基因敲入小鼠海马区分别注射Cre重组酶腺相关病毒和对照腺相关病毒建立Emx2突变和对照小鼠模型.小鼠腹腔注射阈下剂量戊四氮建立慢性点燃癫痫模型,观察比较突变组小鼠和对照组小鼠在点燃时间段中各个时间点的发作级别.以转染野生型EMX2(160Ala)质粒和突变型EMX2(160Ser)质粒的HEK293细胞为实验对象,借助染色质免疫共沉淀-测序技术,比较EMX2作用的靶基因,并对相应的基因类群进行GO功能富集分析和KEGG pathway富集分析.
结果
相较于野生型EMX2,突变型EMX2的亚细胞定位未发生变化;放线菌酮实验提示野生型和突变型EMX2的蛋白稳定性没有明显差异.EMX2基因突变会影响神经元初级神经突和次级神经突的生长发育,并导致皮层神经元的迁移紊乱.在戊四氮慢性点燃癫痫模型中,与对照组小鼠相比,Emx2突变加速了癫痫发生发展的进程,降低了点燃过程中的生存率.染色质免疫共沉淀-测序提示突变后的EMX2失去了对一系列靶基因的精准调控.
结论
基因突变(c.478G>T)可能影响了EMX2对下游靶基因转录的调控,致使神经元迁移发育障碍从而增加了癫痫易感性.
第二部分 KIF17调节癫痫发作的功能探讨
背景:
癫痫是由多种原因引起的慢性脑功能障碍综合症,癫痫的反复发作会给患者的身体和心理健康带来巨大的双重危害.中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡而导致的大脑神经元异常同步化放电被认为是癫痫的重要机制之一,进一步研究影响这种失衡的分子机制对于探索新的抗癫痫药物靶点是很有必要的.既往研究证实,KIF17在神经系统NMDA受体NR2B亚基的转运和调节中发挥着重要作用,我们推测其可能具有调节癫痫发作的潜在功能.
目的:
探讨干预KIF17对癫痫发作的影响及可能机制.
方法:
本研究主要采用分子生物学、重组慢病毒载体构建及海马立体定位注射、海人酸海马内注射诱导颞叶癫痫动物模型及行为学记录分析、全细胞膜片钳等方法.从课题组前期建立的包含难治性颞叶癫痫患者术后脑组织和脑外伤减压术切除脑组织的脑库中随机抽取癫痫脑组织标本和对照组脑组织标本,通过免疫印迹技术检测KIF17的表达情况.通过海人酸海马内注射诱导颞叶癫痫动物模型,获取海马组织,通过免疫印迹技术检测KIF17的表达情况.构建小鼠Kif17基因过表达和敲减的慢病毒载体以及阴性对照病毒载体,通过立体定位注射慢病毒特异性干预海马组织KIF17表达,观察上调或下调KIF17对海人酸模型行为学的影响.通过无镁人工脑脊液灌流建立体外脑片癫痫模型,借助全细胞膜片钳技术记录并分析海马内干预KIF17表达后各组脑片CA1区锥体神经元的动作电位频率,微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs)以及微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs)的频率和幅值.
结果:
免疫印迹结果提示在癫痫患者术后脑组织中,KIF17的表达水平较对照组显著升高;在癫痫小鼠模型的海马组织中,KIF17的表达水平较对照组显著升高.在海人酸诱导的癫痫动物模型中,行为学观察发现,与对照组相比,上调海马组织中KIF17可以缩短癫痫发作潜伏期并增加发作次数,而下调KIF17可以延长癫痫发作潜伏期并减少发作次数.在体外无镁癫痫脑片模型中,海马CA1区锥体神经元膜片钳记录结果提示,与对照组相比,上调海马组织中KIF17可以增加动作电位频率以及mEPSCs的频率和幅值,下调KIF17可以产生相反的效果.KIF17的过表达或敲减对mIPSCs幅值和频率的影响并没有显著差异.
结论:
干预KIF17可能通过影响兴奋性突触传递而调节癫痫发作.