加味黄芪赤风汤对炎症增生中的小鼠系膜细胞凋亡的影响

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背景:肾小球系膜细胞异常增殖是多种肾小球疾病如IgA肾病、膜增殖性肾炎、狼疮性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、糖尿病肾小球硬化的主要病理改变。肾小球系膜细胞异常增殖可引起细胞外基质的过量生成和聚集,进展过程中系膜细胞不仅是受害者,而且通过分泌炎症因子和细胞外基质主动参与肾小球炎症的发展。并最终导致肾小球硬化、肾脏纤维化及终末期肾功能衰竭。因此设法控制系膜细胞增殖对争取逆转肾小球损伤、防止肾脏疾病向慢性化演变具有重要意义。细胞凋亡在肾小球增殖性病变的形成和消散过程中起着非常重要的作用。近年来研究显示,在某些自限性增殖性肾小球疾病中,增殖的肾小球系膜细胞可以通过细胞凋亡机制而自行缓解,使肾小球结构恢复正常。加味黄芪赤风汤是张昱主任医师治疗慢性肾炎的常用方剂,前期研究显示,加味黄芪赤风汤药物血清可以抑制LPS诱导的小鼠系膜细胞的增殖,减少系膜细胞基质中Col-Ⅳ、FN和LN的表达。但对系膜细胞是否有促进凋亡的作用,还未进行相关研究。本实验通过研究加味黄芪赤风汤对炎症增生中的小鼠系膜细胞凋亡的影响,为其临床运用提供实验和理论依据。目的:探讨加味黄芪赤风汤(Modified Hangqichifeng Decoction, MHD)对炎症增生中的小鼠系膜细胞(MMCs)凋亡的影响。方法:加味黄芪赤风汤及替米沙坦大鼠灌胃后,制备含药血清,用含10%含药血清的DMEM培养液体外作用于MMCs,LPS作为炎症增生刺激因子,将细胞分为对照组、LPS组、替米沙坦组、加味黄芪赤风汤高、中、低剂量组。采用1.透射电镜观察MMCs超微结构变化。2.流式细胞仪检测凋亡率(AnnexinV-FITC/PI染色法)。3.Western Blot法检测MMCs中Bcl-2、Bax、 Caspase-3蛋白的表达。结果:①电镜观察下,对照组、LPS组细胞胞体正常,细胞器较多,细胞呈圆形或椭圆形,核仁清晰,核膜边缘光滑、完整。找不到凋亡小体、染色体边集等凋亡结构。替米沙坦组细胞皱缩,呈圆形,细胞包膜见多量突起,包浆内细胞器略减少,拥挤。核仁清晰可见,核膜厚、染色质边集。加味黄芪赤风汤药物血清各剂量组核仁消失,核膜厚,染色质固缩,边集明显。②中药各组凋亡率较LPS组相比,均显著性增高(p<0.01);替米沙坦组较LPS组相比,凋亡增加且有统计学意义(p<0.05);而中药各组之间两两比较,其差异均有统计学意义(p<0.05),且有一定的量效关系;替米沙坦组与中药低剂量组相比,无明显差异(p>0.05),但与中药中剂量和高剂量组相比,差异明显(分别为p<0.05、p<0.01)③空白对照组、脂多糖组与替米沙坦组之间Bcl-2、Bax蛋白的相对表达量之间无明显差异(p>0.05),而中药各组和LPS刺激组和替米沙坦组相比,Bcl-2蛋白的表达显著减少(p<0.01),Bax蛋白的表达显著增多(p<0.01);加味黄芪赤风汤各剂量组内,Bcl-2蛋白的表达随着中药剂量的增高而递减,且中药高剂量组与中剂量组、中药低剂量组相比,Bcl-2蛋白的表达显著减少(p<0.01)。④替米沙坦组、中药各剂量组与空白对照组、脂多糖组之间Caspase-3蛋白的相对表达量有显著差异(p<0.01);中药各组与替米沙坦组相比,MMCs中Caspase-3蛋白水平有显著升高(p<0.01);中药各剂量组之间,随着剂量的升高,各组之间MMCs中Caspase-3蛋白的表达依次升高,且有统计学意义(中药高剂量组和低剂量、中剂量相比,p<0.01;中药中剂量和低剂量相比,p<0.05);⑤与对照组和LPS组相比,替米沙坦组Bcl-2/Bax无明显改变(p>0.05);中药各剂量组和对照组、LPS组相比,Bcl-2/Bax有统计学意义(中药低剂量组与对照组或LPS组相比,p<0.05;中药中剂量组、中药高剂量组与对照组或LPS组相比,p<0.01);中药各组与替米沙坦组相比,Bcl-2/Bax匕值明显减少(中药低剂量组Bcl-2/Bax比值与替米沙坦组相比,p<0.05;中药中剂量、中药高剂量组Bcl-2/Bax比值与替米沙坦组相比,p<0.01)。中药各剂量组之间两两比较有统计学意义(p<0.05),且随着剂量的提高,Bcl-2/Bax比值逐渐减少。结论:①加味黄芪赤风汤能显著促进炎症增生中的MMCs的凋亡,并呈一定的量效关系,作用强于替米沙坦。②加味黄芪赤风汤通过上调Bax、Caspase-3蛋白表达水平,下调Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比值促进细胞凋亡。
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