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第一部分 miR-34a-5p在鼻咽癌组织中的表达及与鼻咽癌患者预后间的关系目的:探讨和分析miR-34a-5p在鼻咽癌组织的表达情况及与鼻.咽癌患者诊断、预后间可能的关系。方法:收集于2010年3月至2012年5月在广西医科大学第一附属医院确诊为鼻咽癌及鼻咽部炎症患者的病理蜡块组织,鼻咽癌患者105例(鼻咽癌组),鼻咽部炎症患者30例(非肿瘤组)。对鼻咽癌组随访时间为13～60月,中位随访时间为47个月。采用qRT-PCR检测鼻咽癌组、非肿瘤组患者组织中miR-34a-5p的基因表达,对鼻咽癌组和非肿瘤组做ROC曲线,并对鼻咽癌组患者生存资料进行Kaplan-Meier分析。结果:(1)鼻咽癌组患者组织中miR-34a-5p的基因表达水平低于非肿瘤组(P<0.001),差异有统计学意义。(2)鼻咽癌组和非肿瘤组ROC曲线结果 AUC=0.7894,95%CI=0.6968-0.8821,说明miR-34a-5p有较好的诊断效能。(3)Kaplan-Meier分析结果表明,miR-34a-5p低表达鼻咽癌患者生存时间较miR-34a-5p高表达鼻咽癌患者生存时间降低(P<0.05)。结论:miR-34a-5p在鼻咽癌患者组织中低表达。miR-34a-5p有成为诊断及预测鼻咽癌患者预后的肿瘤标志物的潜在可能。第二部分 miR-34a-5p在体外对鼻咽癌细胞生物学功能的影响目的:通过体外细胞实验研究探讨miR-34a-5p对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。方法:采用荧光定量qRT-PCR法检测C666-1、CNE1中的miR-34a-5p表达情况;采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1、CNE1,将感染后细胞分为CNE1 PCDH对照组(A组)、CNE1 miR-34a-5p感染组(B 组)、C666-1 PCDH 对照组(C 组)、C666-1 miR-34a-5p 感染组(D组),qRT-PCR法检测上述细胞中miR-34a-5p表达;CCK8法检测各组细胞增殖率,细胞集落形成实验检测各组细胞克隆形成能力;细胞侵袭实验(Transwell法)检测各组细胞侵袭能力;细胞迁移实验检测各组细胞迁移能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:(1)鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1中的miR-34a-5p呈低表达。(2)miR-34a-5p感染组(B组和D组)的miR-34a-5p的基因表达较C666-1、CNE1细胞表达高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)B组和D组的细胞增殖率、细胞克隆形成能力、细胞侵袭能力、细胞迁移能力较A组和C组下降,差异有统计学意义。(4)B组和D组的细胞凋亡率较A组和C组升高,差异有统计学意义。结论:miR-34a-5p表达上升可以促进鼻咽癌细胞凋亡,抑制鼻咽癌细胞的增殖、生长、克隆形成和侵袭能力,提示miR-34a-5p在鼻咽癌细胞中可能是一种起重要作用的抑癌因子。第三部分 miR-34a-5p在体内对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响目的:探讨miR-34a-5p在体内对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法:采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1,裸鼠随机分为 C666-1 miR-34a-5p 感染组(5 只)、C666-1 PCDH 对照组(5 只),将感染后细胞悬液注射到裸鼠左腋皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型。结果:与C666-1 PCDH对照组比较,C666-1 miR-34a-5p转染组裸鼠移植瘤的重量和体积减少,差异有统计学意义。结论:miR-34a-5p高表达可以抑制裸鼠鼻咽癌细胞移植瘤的生长,提示miR-34a-5p在鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤中可能是一种起重要作用的抑癌因子。第四部分 miR-34a-5p靶基因预测及生物信息学分析目的:通过miRNA数据库来预测miR-34a-5p潜在靶基因及信号通路。方法:通过 miRanda、miRTarBase、miRDB 和 TargetScan 网站分别预测miR-34a-5p靶基因,并将每个网站预测到的靶基因取交集。对交集部分的靶基因进行GO和KEGG富集分析,得出可能参与的细胞过程、细胞组分、分子功能及潜在的调控通路。结果:GO分析结果中,Notch信号通路、细胞免疫、凋亡、细胞增殖、有丝分裂、DNA复制等被富集。而KEGG分析也富集到Notch signaling pathway、miRNAs in cancer等信号通路。通过靶基因预测网站查询到miR-34a-5p与NOTCH1有结合位点。结论:通过生物信息学的方法推测出NOTCH1基因的3’UTR含有预测的miR-34a-5p的结合位点。提示miR-34a-5p靶基因很可能是NOTCH1,并通过NOTCH信号通路来调控细胞。第五部分 miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌抑癌作用的分子机制探讨目的:探讨miR-34a-5p靶向调控NOTCH1对鼻咽癌抑癌作用的分子机制。方法:采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1、CNE1,将感染后细胞分为CNE1 PCDH对照组(A组)、CNE1 miR-34a-5p感染组(B 组)、C666-1 PCDH 对照组(C 组)、C666-1 miR-34a-5p 感染组(D组),采用qRT-PCR法检测NOTCH 1基因表达,采用western blot检测NOTCH1、Hes-1蛋白表达;采用慢病毒包装的miR-34a-5p、PCDH感染C666-1,裸鼠随机分为C666-1 miR-34a-5p感染组、C666-1 PCDH对照组,将感染后细胞悬液注射到裸鼠左腋皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型。结果:(1)与A组和C组(对照组)相比,B组和D组(miR-34a-5p感染组)的NOTCH1基因表达和NOTCH1、Hes-1蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义。(2)与C666-1 PCDH裸鼠对照组相比,C666-1 miR-34a-5p组的裸鼠的NOTCH1基因和NOTCH1、Hes-1蛋白水平显著降低,差异具有统计学意义。(3)荧光素酶报告实验结果说明,NOTCH1是miR-34a-5p的一个靶基因。而且当miR-34a-5p表达量上升时,NOTCH 1的表达会相应降低。结论:miR-34a-5p抑制鼻咽癌生长的主要分子机制是降低了靶基因Notch1的表达,并可能影响NOTCH通路下游基因。