鲢对低氧胁迫的机体和分子响应研究

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为探究低氧胁迫下鲢(Hypophthalmichthys molitrix)的机体和分子响应,本研究通过对不同氧浓度胁迫下的鳃组织结构进行组织学观察,测定鲢肝脏和血清中的抗氧化酶活性;转录组测序分析低氧胁迫相关的信号通路及差异表达基因;并克隆了葡萄糖转运蛋白基因GLUT1,分析其在不同氧浓度胁迫下的组织表达特征。研究结果初步明确了低氧胁迫对鲢的机体影响以及在不同氧浓度胁迫下鲢在生理生化和分子响应基础。主要研究结果如下:(1)低氧胁迫对鲢组织结构和抗氧化应激的影响为探究低氧胁迫对组织结构以及抗氧化酶活力的影响,本研究分别在常氧(DO:6.42±0.3)mg/L、浮头(0.76±0.03)mg/L,半窒息(0.58±0.06)mg/L和窒息(0.27±0.06)mg/L时观察鳃组织结构的变化、测定过氧化氢酶(Superoxide dismutase,SOD),过氧化氢酶(Catalases,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)活性以及超氧化物歧化酶(SODs)基因表达特征,结果表明低氧胁迫对鲢鳃组织结构造成了不同程度的损伤,鳃小片随着氧浓度的降低逐渐呈“S”型严重弯曲,且线粒体丰富细胞、扁平上皮细胞也出现了不同程度的损伤,随着溶解氧浓度的降低,损伤程度加剧。低氧胁迫下鲢肝脏和血清中的抗氧化酶活系统发生响应,过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在血清中呈增加趋势,其中CAT活力在半窒息时达到最大(P<0.05),GPX酶活力无显著变化,超氧化物歧化酶(SOD)活力在低氧胁迫时均显著低于常氧状态(P<0.05)。肝脏中SOD、CAT酶活力均在浮头时升至最高点,随后在窒息时降至最低(P<0.05),GPX酶活力在半窒息达到最大值,相比常氧组无显著差异(P>0.05)。肝脏中Cu/Zn-SOD m RNA表达量在浮头和窒息时相比于常氧组有显著差异,鳃中Cu/Zn-SOD表达量在低氧胁迫组均显著低于常氧组;Mn-SOD基因在肝脏中的相对表达量先升高后下降,在半窒息时显著降低(P<0.05);鳃中Mn-SOD在浮头时的表达量显著降低后趋于平稳。鲢对低氧胁迫产生氧化应激,但其可以通过自身的抗氧化系统进行调节,而当氧浓度过低时机体出现损伤,甚至死亡。(2)低氧胁迫下鲢鳃组织的转录组分析为探究不同氧浓度胁迫后的鳃组织中分子水平响应,对其鳃组织进行转录组测序,结果表明,与常氧相比鉴定出2060个差异表达基因,其中浮头时有587个差异表达基因(DEGs),半窒息时725个DEGs,窒息时748个DEGs。在所有低氧处理中,有224个DEGs持续共表达。KEGG Pathway差异富集性分析结果显示,差异表达基因在细胞色素P450代谢物(Cytochrome P450metabolic pathway)、FOXO信号通路(FOXO signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)和MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)中显著富集,同时细胞色素P450(CYP)和低氧诱导因子(HIFs)基因家族在低氧胁迫过程中广泛表达。选取七个差异基因进行q RT-PCR验证,结果显示其与m RNA测序结果在上调和下调趋势是完全一致的,这一结果验证了转录组测序分析的准确性较好。(3)鲢GLUT1基因的克隆和表达特征基于转录组获得的GLUT1基因片段,利用RACE技术克隆获得鲢GLUT1基因全长,并利用q RT-PCR技术对其在不同氧浓度胁迫下m RNA表达特征进行分析。GLUT1基因全长2104 bp,ORF编码490个氨基酸残基,其中包括34个强酸性氨基酸(Asp+Glu)和37个强碱性氨基酸(Arg+Lys),预测分子量为53.92 k D,理论等电点(pI)为8.47,氨基酸序列包括22个丝氨酸(Ser)、10个苏氨酸(Thr)和4个酪氨酸等蛋白激酶磷酸化位点。邻接法(neighborjoining,NJ)法构建的GLUT1系统进化树显示,鲢GLUT1基因先与其鲤科的草鱼聚为一支,再与鲤鱼、斑马鱼和虹鳟等鱼类聚为一支,亲缘关系最近,形成一个相对独立的大分支,然后与其他鱼类和哺乳类聚为一支,与其分类地位一致。qRT-PCR检测GLUT1基因在脑、鳃、心脏、肝脏、肾脏、肠、肌肉和脾脏8个组织中的表达,结果表明GLUT1基因相对表达量由高到低分别是鳃、脾脏、脑、心脏、肠、肾脏、肌肉和肝脏,在鳃中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。不同氧浓度胁迫下,GLUT1基因在肝脏、脑、心脏、鳃中的表达特征也不尽相同。在脑、心脏、肝脏中不同浓度低氧胁迫时GLUT1的表达量均显著高于常氧组(P<0.05),而在鳃组织中,GLUT1在浮头和半窒息时的表达量均显著上升后在窒息时又显著降低(P<0.05)。在脑中,GLUT1基因在浮头时表达量达到最大,相比常氧状态时具有显著差异(P<0.05),而随着氧浓度的降低,GLUT1的表达量也随之降低,但仍显著高于常氧时的表达量(P<0.05)。在肝脏中,GLUT1在浮头、半窒息和窒息时的表达量均显著高于常氧状态(P<0.05)。在心脏中GLUT1的表达量随着溶解氧浓度的降低而增加,在浮头、半窒息和窒息时的表达量均显著高于常氧状态(P<0.05)。本研究明确了鲢GLUT1的基因结构特征、时空表达特征及对低氧胁迫的响应规律,丰富了淡水鱼类低氧应答相关基因的研究资料。
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