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实验目的:1.最近的研究结果表明,通过抑制补体系统的活性可以有效用于治疗T细胞介导的自身免疫性疾病。然而,在自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中,补体过敏毒素受体C3a R和C5a R对T细胞的调节作用尚不明确。因此,本课题通过比较野生型(wildtype,WT)小鼠与补体过敏毒素受体C3a R/C5a R双基因敲除(double knockout,DKO)小鼠之间EAU的表现,以及葡萄膜炎致病性T细胞的功能来明确C3a R和C5a R在EAU病程发展中的重要性。2.体内的补体系统需要激活后才能发挥作用,虽然已有报道显示旁路途径的激活对EAU发病轻重产生影响,但是经典途径以及凝集素途径的激活对EAU发病的作用还尚不清楚。C4是经典途径以及凝集素途径中的共同成分,C1q是经典途径中的启动因子。因此,本课题进一步通过诱导WT与C4KO、C1q KO小鼠的EAU,明确补体激活经典途径与凝集素途径对EAU的影响。实验方法:1.利用光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor binding protein,IRBP)多肽片段651-670,分别诱导C57BL/6J WT小鼠和C3a R/C5a R DKO小鼠EAU发病模型。免疫后,通过间接眼底镜每日观察疾病的发展过程,记录下临床评分。免疫进行两周后,进行眼底视网膜成像——包括局部内窥镜眼底成像(topical endoscopic fundus imaging,TEFI),共焦激光扫描眼底镜(confocal scanning laser ophthalmoscopy,c SLO),光学相干断层扫描(spectral domain optical coherence tomography,SD-OCT)以及视网膜功能电生理检查。观察结束后,取眼球石蜡包埋切片HE染色进行组织病理学评估。主动免疫第2或3周,取脾脏分离脾细胞,在含IRBP抗原的培养基中进行体外培养,另设EAU不相关抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)多肽片段323-339以及无抗原组做为实验对照,72小时后用ELISA测定细胞上清液中Th1,Th17相关细胞因子IFN-γ,IL-17。在过继转移诱导EAU发病的实验中,分别主动免疫WT与DKO小鼠,第14天分离出脾脏中的T细胞,体外IRBP刺激培养扩增抗原特异性T细胞,过继转移至na?ve WT小鼠诱导眼部炎症。2.除此之外,利用IRBP 651-670分别诱导WT与C4KO,C1q KO小鼠EAU模型。除上述的临床观察,视网膜成像,组织病理学评估,T细胞召回实验以及细胞培养上清中IFN-γ,IL-17检测以外,还利用IRBP 651-670特异性MHC-I/多肽四聚体复合物(Tetramer复合物)进行抗原特异性CD4阳性T细胞检测。为比较WT与C4KO小鼠抗原提呈细胞的功能,体外分别培养小鼠骨髓来源树突细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs),诱导成熟后与转基因OTII小鼠的脾脏T细胞在含有OVA多肽片段323-339的条件下共培养,72小时后利用CFSE标记检测脾脏细胞的增殖。为检测WT与C4KO小鼠脾脏中致病性T细胞的活性,磁珠分选小鼠脾脏细胞中CD4阳性的T细胞,在Th0及Th1分化条件的培养基中体外培养,并在不同的时间点分别使用CD25,CD69抗体检测T细胞激活标记物;Brdu和CFSE标记分析T细胞增殖;Annexin V和PI染色分析T细胞凋亡;IFN-γ抗体检测T细胞分化。实验结果:1.EAU诱导后,临床评分,视网膜成像,组织病理学评分的结果一致,均显示出DKO比WT小鼠表现出较轻的炎症。电生理检测显示DKO EAU小鼠的视网膜功能明显优于WT EAU小鼠。T细胞体外召回实验结果表明,DKO EAU小鼠脾脏细胞对IRBP的免疫应答低于WT对照组,表现为细胞培养上清液中IFN-γ与IL-17的水平明显减低。另外,T细胞过继转移诱导EAU的实验表明,来自WT EAU小鼠脾脏中的IRBP特异性T细胞,其致病能力明显强于DKO EAU小鼠的T细胞,能够诱导na?ve小鼠表现出更加严重的葡萄膜炎。2.C4KO比WT小鼠EAU的发病明显减轻,但C1q KO与WT小鼠的炎症表现无显著差异。视网膜成像、组织病理学评分,以及T细胞体外召回实验的结果与临床观察结果相一致。此外,Tetramer染色结果表明C4KO EAU小鼠脾脏细胞中IRBP特异性T细胞比例明显低于WT对照组。3.C4KO小鼠骨髓来源的树突细胞抗原提呈能力与WT小鼠并无明显区别,但是其脾脏中CD4阳性T细胞在体外培养条件下活化,增殖,分化能力均不及WT小鼠CD4阳性T细胞,同时比来自WT的CD4阳性T细胞更易诱导凋亡。实验结论:1.补体过敏毒素C3a和C5a及其受体C3a R和C5a R,在EAU的病程中发挥重要作用。2.补体激活经典途径与凝集素途径共同成分C4对EAU的发展有显著影响,然而经典途径启动分子C1q对EAU的影响并不明显。C4可能是通过增强T细胞的活化,增殖,分化以及抑制T细胞凋亡对EAU的发病起到促进作用。3.抑制补体系统的激活有可能成为治疗自身免疫性葡萄膜炎的新靶点。