纤毛虫原生动物是一种高度分化的单细胞真核生物。当环境不良时,它能形成休眠包囊,外界条件转好时再脱包囊成营养细胞。形成包囊时,细胞形态会发生一系列变化,这是一种受到多种基因共同调控的生命现象。对纤毛虫细胞休眠现象的研究,不仅有助于了解真核生物在逆境下细胞物质合成与代谢及信号传递机制,还能为进一步探索真核细胞结构和功能、起源和进化等方面提供新的资料。有关纤毛虫休眠过程的形态学研究虽有一定积累,但是对皮层纤毛器的去分化规律了解较少;而对于纤毛虫休眠相关的分子机制,因研究起步较晚,知之甚少。本研究以三伪尖毛虫(Oxytricha trifallax)为实验材料,应用电子显微镜技术和转录组技术对三伪尖毛虫营养细胞和休眠包囊的形态和基因表达情况进行了研究,观察了其形成包囊时胞质内细胞器变化、皮层纤毛器的连续性分化过程,探索了休眠相关基因和信号通路的调控机制。1.三伪尖毛虫营养期和包囊期细胞形态研究三伪尖毛虫营养期细胞长约55μm,宽约24μm,腹面纤毛为典型的尖毛虫“8-5-5”模式,具有6列背触毛。形成包囊时,腹面纤毛器中波动膜、口庭、口围带先瓦解,Ⅴ/3、Ⅴ/4及位于细胞中部6-7根缘棘毛依次向细胞质内抽缩成短小棘毛并暂停吸收,之后Ⅳ/2、Ⅴ/2、Ⅵ/2及剩余缘棘毛依次消失,额腹区棘毛在细胞变成球形后先聚集再瓦解,最后暂停吸收的短棘毛被吸收;与腹面纤毛器去分化不同的是,背触毛单元的裸毛基体再分化长出纤毛,形成具有两根纤毛结构的背触毛单元。最终成熟的包囊直径约为15μm,表面具有褶皱,包囊壁为典型的4层;胞质中有大量的自噬泡、线粒体等胞器;2枚大核融和为1枚,小核1枚或多枚,呈圆球形。结果表明:(1)三伪尖毛虫形成毛基体吸收型包囊,休眠过程中,腹面纤毛器有序依次地去分化,而背触毛则出现再分化;(2)比较该过程及已有其他纤毛虫纤毛器去分化的报道可知,腹面纤毛器去分化规律很可能因种而异,但亲缘关系越近则越为相似;(3)三伪尖毛虫背触毛的再分化现象与前人报道过的凯氏异毛虫(Allotricha curdsi)一致,可能是尖毛虫类纤毛虫的共有特征;(4)三伪尖毛虫与大部分腹毛类纤毛虫纤毛器的去分化都起始于口器,可能是纤毛虫休眠开始时会停止摄食的原因。2.三伪尖毛虫休眠相关基因的研究应用转录组技术对纤毛虫O.trifallax营养体和包囊的基因表达情况进行了研究,测得的转录组数据及生物信息学分析结果显示:(1)共测得营养体和包囊差异转录本809条,与营养体相比,包囊中511条m RNA为上调表达,298条m RNA为下调表达;(2)对这些差异表达m RNA进行GO功能注释,有586条m RNA匹配到了GO注释,共注释到1337个GO条目:上调表达的286条m RNA共注释到963个GO条目,下调表达的200条m RNA匹配到516个GO注释条目;(3)这些差异条目的富集在三大类中:主要与糖类、脂质和蛋白质代谢及细胞分裂相关的生物过程,溶酶体、胞外空间和细胞壁的细胞组分,以及磷酸激酶、氧化酶、肽酶、超氧化物歧化酶等酶类的分子功能相关;(4)对这些差异转录本进行KEGG分析,共映射到207条不同的通路中,与营养细胞相比,休眠包囊的上调转录本注释到144条通路,下调转录本注释到180条通路,其中显著富集的通路有溶酶体、c AMP、花生四烯酸代谢、细胞凋亡、三羧酸循环、自噬、谷胱甘肽代谢、抗原处理与呈递、鞘脂糖合成、脂肪酸延长以及氨基酸合成等。分析结果表明:(1)与肾形虫和阿米巴虫形成包囊时细胞内c AMP水平升高一致,三伪尖毛虫包囊中c AMP通路中的钙调蛋白激酶和Na+-K+-ATP酶α亚基相关基因表达上调,这可能证明c AMP通路会参与原生动物的休眠调控;(2)同时在饥饿、拥挤等不良环境中,细胞还优先表达大量HSP70蛋白,进而促进谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶及SDR家族还原酶等内源性氧化酶水平,启动应激反应机制来降低环境对细胞的胁迫;(3)此外,与透射电镜下观察到包囊中出现的大量自噬泡结构相对应,应用转录组技术也筛选到了自噬和溶酶体通路中组织蛋白酶D、L、B的差异性表达,这可能与蛋白质降解、包囊壁形成以及休眠期营养物质供应相关;(4)三伪尖毛虫的差异表达基因显著富集在自噬和溶酶体通路中,但这一现象在同为腹毛类的冠突伪尾柱虫研究中未见报道。这可能是因为与“毛基体部分吸收型包囊”类纤毛虫相比,“毛基体吸收型包囊”类纤毛虫在形成包囊时,自噬现象更为明显。纤毛虫营养体形成包囊是一个稳定有序的分化过程,受到多种基因及信号通路的共同调控,而这些差异表达基因和信号通路起到了至关重要的作用。本研究比较细致地观察了皮层纤毛器的分化顺序和特征,可为研究不同生理条件下纤毛虫细胞结构分化特征研究提供相关素材。在形态学的基础上,还运用转录组学技术探索了毛基体吸收型包囊的休眠相关基因,丰富了不同包囊类型纤毛虫休眠机制的分子水平研究资料。