前言:视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury，RIR)是指各种原因导致视网膜缺血一定时间，再次恢复血液供应后，视网膜组织的损伤进一步加重的现象。RIR是眼科一种较为常见的病理过程，参与了多种疾病的发生，如青光眼急性大发作、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变、糖尿病视网膜病变等。由于缺血缺氧引起视网膜神经元细胞的坏死、凋亡等严重损害，其组织学变化的主要特点为视网膜神经细胞数目减少、视网膜萎缩变薄，最终严重损害视神经的功能。长久以来，RIR的发病机制及临床治疗一直是眼科学研究的热点。　　 Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase ROCK)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Tkr蛋白激酶)，可被上游的Rho-GTP激活，活化的Rho激酶使其底物肌球蛋白轻链(Myosin light chain，MLC)磷酸化，调节细胞肌动蛋白骨架的重组，从而广泛参与细胞凋亡、细胞游走及浸润、细胞有丝分裂、肌肉细胞收缩等一系列生物学过程。研究表明：Rho/Rho激酶通路参与了组织缺血再灌注损伤，Rho激酶抑制剂Fasudil可以抑制组织缺血再灌注后引起的iNOS蛋白表达增加，Fasudil还能够抑制炎性细胞游走、粘附、浸润等，并降低炎性细胞分泌炎性因子，从而抑制局部的炎性反应，减轻损伤；阻断Rho/Rho激酶通路的激活还可抑制细胞凋亡时胞膜小泡形成的形态学改变，具有抗细胞凋亡作用；阻断Rho/Rho激酶通路具有神经保护作用，Fasudil可减轻谷氨酸诱导的神经元损害，降低NMDA所致的神经毒性，促进神经细胞的存活。　　 视网膜缺血缺氧后，局部组织内促凋亡基因表达增强、iNOS等炎症因子表达增加、NO及自由基等毒性产物增多、神经营养因子剥夺、中性粒细胞浸润，Ca2+超载、兴奋性氨基酸受体NMDA增多等因素对RIR的发病起到非常重要的作用。根据目前发现的阻断Rho/Rho激酶通路后所产生的抗炎、抗凋亡及神经保护作用，本实验拟采用急性升高眼压的方法制作大鼠RIR模型，通过玻璃体腔注射Rho激酶抑制剂Fasudil的方式阻断Rho激酶的激活，观察Fasudil治疗前后视网膜组织形态学的改变，并用TUNEL方法检测Fasudil治疗前后视网膜细胞凋亡的改变，来判断Fasudil对RIR是否有保护作用。　　 视网膜缺血再灌注损伤后，有多种凋亡相关基因表达异常，如Caspases-3，Bcl-2、Bax等。Caspase-3蛋白酶可直接切断DNA引起凋亡发生，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路；Bcl-2是一个抗凋亡基因，它通过与一些促凋亡基因结合来实现其抗凋亡作用，而Bax则起到促凋亡作用。本实验用Western Blot方法检测Fasudil治疗前后Caspase-3蛋白表达的变化，用Real-time PCR方法检测Fasudil治疗前后凋亡相关基因Bcl-2 mRNA及Bax mRNA的表达变化，探讨Fasudil对RIR大鼠视网膜细胞的抗凋亡作用。　　 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与RIR的关系十分密切，在视网膜缺血再灌注损伤后，由于受到各种内外因子的刺激，视网膜内iNOS表达增加，iNOS被激活后释放大量的NO，NO经过复杂的机制引起视网膜损伤。本实验用免疫组化、WesternBlot及Real-time PCR的方法检测大鼠视网膜iNOS表达的变化，观察Fasudil对大鼠RIR诱导的iNOS表达的影响，旨在探讨Fasudil对RIR保护的机制，为视网膜缺血性疾病的治疗提供理论依据。　　 方法:　　 1、将大鼠随机分为正常组、视网膜缺血再灌注损伤组、生理盐水对照组、Fasudil低剂量(10μM)治疗组和Fasudil高剂量(30μM)治疗组。正常组不加任何处理因素；缺血再灌注损伤组只制作动物模型；对照组和治疗组采用玻璃体腔注射方法，向玻璃体腔内分别注入生理盐水和不同稀释浓度的Fasudil药液(Fasudil眼内最终浓度为10μM或30μM)4ul。给药5分钟后，采用急性升高眼压方法建立RIR模型。　　 2、于缺血再灌注损伤后24小时和168小时处死各组动物，摘除眼球制作4μm厚石蜡切片，HE染色光镜下观察损伤后24小时和168小时各组大鼠视网膜组织病理学变化及视网膜厚度变化；末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测损伤后24小时各组大鼠视网膜细胞凋亡情况，计算凋亡指数(AI)。　　 3、于缺血再灌注损伤后24小时处死各组动物，取视网膜组织，Western blotting检测各组大鼠视网膜Caspase-3蛋白表达量，Real-time PCR检测各组大鼠视网膜Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表达量。　　 4、免疫化学法检测损伤后24小时各组大鼠视网膜iNOS的表达分布情况，Western blotting检测损伤后24小时各组大鼠视网膜iNOS蛋白表达量；Real-timePCR检测损伤后24小时各组大鼠视网膜iNOS mRNA表达。　　 5、统计学处理：数据以均数±标准差(χ±s)表示，应用SPSS15.0软件统计分析，对同一时间点各组数据行单因素方差分析并用LSD检验及Dunnetts T3检验，P<0.05表示有统计学差异。　　 结果:　　 1、光镜下观察：正常组大鼠视网膜组织结构清晰可见，三层细胞排列整齐，神经纤维层及内、外丛状层呈疏松网状结构。缺血再灌注损伤24小时后视网膜神经节细胞以及内、外核层水肿明显，细胞排列紊乱，内、外丛状层疏松增厚；168小时后，视网膜厚度变薄，呈萎缩状，神经节细胞层及内、外核层细胞减少。损伤后24小时Fasudil治疗组视网膜水肿程度较生理盐水对照组减轻；损伤后168小时Fasudil治疗组视网膜厚度变薄及细胞丢失情况轻于生理盐水对照组。　　 2、视网膜厚度测量：与正常组相比，缺血再灌注损伤24小时后视网膜厚度增加，168小时后视网膜厚度变薄，差异具有显著性(P<0.05)。Fasudil两种剂量治疗组其视网膜厚度在损伤后24小时低于生理盐水对照组，在损伤后168小时高于生理盐水对照组，高剂量治疗组作用更明显，差异具有显著性(P<0.05)。　　 3、TUNEL检测：正常大鼠视网膜TUNEL染色阳性细胞少，缺血再灌注损伤24小时后，视网膜神经节细胞层及内核层TUNEL阳性细胞增加，凋亡指数与正常组相比有统计学差异(P<0.05)。两个不同剂量Fasudil治疗组视网膜TUNEL染色阳性细胞均减少，其凋亡指数均低于生理盐水对照组，高剂量治疗组减少更为明显，差异具有显著性(P<0.05)。　　 4、Western Blot检测视网膜Caspase-3蛋白表达：与正常组相比，缺血再灌注损伤24小时后视网膜Caspase-3蛋白表达量增加(P<0.05)。与生理盐水对照组相比，两个不同剂量Fasudil治疗组Caspase-3蛋白表达量降低，高剂量治疗组降低更为明显，差异具有显著性(P<0.05)。　　 5、Real-time PCR检测视网膜Bax mRNA表达：与正常大鼠相比，缺血再灌注损伤24小时后大鼠视网膜Bax mRNA表达增加。与生理盐水对照组相比，应用不同剂量的Fasudil治疗后，视网膜Bax mRNA的表达量降低，高剂量治疗组降低更为明显，差异具有显著性(P<0.05)。　　 6、Real-time PCR检测视网膜Bcl-2 mRNA表达：与正常大鼠相比，缺血再灌注损伤24小时后大鼠视网膜Bcl-2 mRNA表达增加。两个不同剂量的Fasudil治疗组视网膜Bcl-2 mRNA的表达高于生理盐水对照组，差异有显著性(P<0.05)，两个不同剂量之间无明显差异(P>0.05)。　　 7、免疫组织化学检测视网膜iNOS表达分布：显微镜下观察，正常大鼠视网膜iNOS表达分布于神经节细胞层、内丛状层、外丛状层阳性，表达微弱；视网膜缺血再灌注损伤24小时后，iNOS表达明显增强；两个不同剂量Fasudil治疗组与盐水对照组相比iNOS表达强度减弱。　　 8、Western Blot检测视网膜iNOS蛋白表达：iNOS在正常大鼠视网膜中几乎不表达，缺血再灌注损伤24小时后表达增强。Fasudil两个剂量治疗组iNOS蛋白的表达量均低于生理盐水对照组，高剂量治疗组降低更为明显，差异具有显著性(P<0.05)。　　 9、Real-time PCR检测视网膜iNOS mRNA表达：与正常大鼠相比，缺血再灌注损伤24小时后大鼠视网膜iNOS mRNA表达增加，与盐水对照组相比，两个不同剂量Fasudil治疗组视网膜iNOS mRNA的表达均降低，高剂量治疗组降低更为明显，差异具有显著性(P<0.05)。　　 结论:　　 1、急性高眼压可诱发视网膜发生缺血再灌注损伤，早期引起视网膜水肿、细胞坏死、凋亡，晚期导致视网膜萎缩，厚度变薄。　　 2、Fasudil玻璃体腔注射能够减轻大鼠RIR所致的组织病理学变化，减轻24小时的组织水肿改变及神经节细胞凋亡，减少168小时的视网膜厚度降低，减轻萎缩，对视网膜具有保护作用。　　 3、Fasudil玻璃体腔注射对RIR的保护作用与降低Caspase-3蛋白表达、降低BaxmRNA表达、增加Bcl-2mRNA表达有关。　　 4、大鼠视网膜缺血再灌注损伤24小时后视网膜iNOS蛋白及iNOSmRNA表达增加，其表达分布于神经节细胞层、内丛状层及外丛状层。　　 5、Fasudil玻璃体腔注射对RIR的保护作用与降低iNOS蛋白及iNOSmRNA的表达有关。　　 6、在一定范围内，Fasudil的保护作用随剂量增加而增强。