慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是主要发生在中老年人群的一种具有特定免疫表型特征的淋巴系统恶性肿瘤,以成熟样的小B淋巴细胞聚集于外周血、骨髓、淋巴结和脾脏为特征,在病因、病程及疗效等方面呈高度异质性。TP53异常、免疫球蛋白重链可变区基因(Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region,IGHV)突变状态、临床分期(Rai分期、Binet分期)、p2微球蛋白水平及年龄等特征可为该病的预后判断提供重要依据。其中,携带TP53基因突变或缺失的病人预后极差,且对常规的免疫化疗方案治疗反应不佳,是难治复发CLL治疗的攻关难题。目前新型靶向治疗药物,如布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK)抑制剂依鲁替尼(ibrutinib)、Bcl-2(b cell lymphoma-2)抑制剂venetoclax、PI3K(phosphoinositide 3-kinase)抑制剂idelalisib等使部分高危CLL病人有生存获益,但仍有部分CLL病人未能达到临床缓解。临床亟待有效调控p53的新型靶向药物及新的治疗方案以突破CLL的治疗瓶颈,有效改善CLL患者预后。母系胚胎亮氨酸拉链激酶(Maternal embryonic leucine zipper kinase,MELK),又称MPK38,是Snf1/AMPK家族成员中的一种细胞周期依赖性的丝/苏氨酸蛋白激酶。MELK在增殖细胞如胚胎干细胞、造血干细胞、肿瘤干细胞中高表达,磷酸化调控下游靶蛋白的活性,参与干细胞分化、细胞周期调控、细胞增殖、凋亡、侵袭与转移等功能。最新研究发现,MELK可通过调控p53信号通路影响肿瘤干细胞生长,是肿瘤发生发展的关键驱动基因。而且,MELK在多种肿瘤如胶质瘤、前列腺、黑色素瘤等和血液系统恶性肿瘤如多发性骨髓瘤中表达明显升高,并与疾病高级别、生存期缩短、化疗敏感性降低等显著相关,是预后不良的生物标记物和肿瘤治疗的潜在靶点。在精准医疗时代,小分子靶向药物已取得较好的临床获益,其应用在肿瘤治疗中的地位愈显重要。MELK的高效靶向抑制剂——OTSSP167(IC50=0.41nM),是一种口服的小分子抑制剂,该化合物通过阻断MELK底物PSMA1和DBNL的磷酸化而发挥作用。OTSSP167可通过调控p53信号通路、细胞周期等生物学功能发挥抗肿瘤抑制作用,在多种恶性肿瘤,如胶质瘤、卵巢癌和多发性骨髓等中均有报道。目前在乳腺癌和急性髓系白血病进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验,已取得阶段性结果,临床应用前景广阔。然而,MELK在CLL发生发展中的作用及机制仍不甚清楚,OTSSP167在CLL是否具有治疗潜力也尚不明确,值得进一步探究。本研究通过观察MELK基因在CLL的表达情况及临床意义,进一步研究MELK基因及靶向小分子抑制剂OTSSP167在CLL中的生物学作用及机制,为CLL的疾病判断、预后风险评估及新型靶向治疗提供理论依据和实验基础,有望揭示MELK调控CLL发生发展和靶向干预的机制,推动OTSSP167在CLL的临床应用,指导CLL的新型靶向治疗。第一部分:MELK在慢性淋巴细胞白血病发生发展中的生物学作用及临床意义目的:本研究旨在检测MELK基因在慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞株及CLL原代细胞中的表达情况,结合CLL病人临床病理指标和预后信息,进一步探究MELK基因在CLL的临床预后意义;分析MELK在CLL基因表达谱富集的生物学过程、参与的细胞信号通路及基因集,预测MELK基因在CLL发生发展中的生物学功能;研究CRISPR/Cas9 MELK基因敲除、shRNA基因敲减及基因过表达对CLL细胞增殖、凋亡、细胞周期、趋化作用及药物敏感性的效应及机制。材料与方法:1.临床标本收集;2.外周血单个核细胞分离;3.免疫磁珠分选CD19+B细胞;4.细胞培养;5.实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR);6.蛋白提取及免疫印迹(WesternBlotting);7.公共数据平台高通量基因表达数据提取、生物信息学分析;8.CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的MELK基因敲除慢病毒转染CLL细胞株;9.MELK shRNA敲减慢病毒转染CLL细胞;10.MELK过表达腺病毒转染CLL细胞;11.Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖;12.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;13.PI/RNase法检测细胞周期;14.Transwell法检测CXCL12诱导细胞趋化,流式细胞仪细胞计数;15.统计学分析。结果:1.实时荧光定量PCR和Western Blotting结果显示,以健康志愿者B细胞为对照组,纳入的55例初治CLL病人原代细胞和CLL细胞株(MEC1、EHEB)中MELK在mRNA和蛋白水平表达量明显增高(p<0.001)。2.MELK高表达与CLL病人白细胞升高、Binet高级别分期、Rai晚期、LDH升高、β2-MG增加、未突变型IGHV基因、ZAP-70阳性和染色体17p13缺失呈统计学相关。MELK表达量与病人的总体生存率呈显著性差异(HR=6.189,p<0.001)。同时,MELK提示CLL病人不良预后在CLL基因组数据库GSE22762得到验证。3.在CLL基因组数据库中,MELK相关基因的GO功能注释分析结果显示MELK与CLL细胞增殖、细胞周期调控和药物敏感性紧密相关;KEGG通路富集分析结果提示MELK可能参与调控p53通路进而发挥在CLL中的生物学功能;GSEA基因富集分析揭示MELK与CLL细胞增殖、凋亡、G2/M细胞周期调控和细胞迁移功能相关。4.采用MELK敲减慢病毒(shMELK)及阴性对照慢病毒稳定转染MEC1、EHEB细胞。与转染对照组相比,转染shMELK的CLL细胞增殖活性明显降低(p<0.01),凋亡细胞明显增多(p<0.05),细胞周期阻滞于G2/M期,CXCL12诱导的细胞趋化作用降低,CLL细胞对氟达拉滨、依鲁替尼的敏感性增加。5.采用MELK过表达腺病毒(Adv-MELK)瞬时转染MEC1、EHEB细胞。与转染对照组相比,转染Adv-MELK的CLL细胞增殖活性明显增加,CXCL12诱导的细胞趋化作用提高,CLL细胞对氟达拉滨、依鲁替尼的敏感性降低。6.采用CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的MELK基因敲除(sgMELK)慢病毒转染MEC1细胞,CLL细胞增殖明显降低,诱发明显凋亡现象,且出现G2/M期细胞阻滞。同时,Western Blotting结果显示p21蛋白增加,提示MELK基因在p53缺失的情况下可通过调控细胞周期影响CLL疾病发展。结论:MELK在CLL细胞中表达异常增高,与患者预后不良相关。MELK可能通过参与细胞增殖、凋亡、细胞周期等生物学过程和p53信号通路影响CLL疾病的进展。上述研究证实,MELK基因敲除、敲减后,CLL细胞增殖减慢、细胞凋亡增加、G2/M细胞周期阻滞、细胞趋化减弱、氟达拉滨及依鲁替尼药物敏感性增高。MELK过表达后,CLL细胞增殖加快,药物敏感性减弱。本研究结果将为CLL的疾病判断、精准预后风险评估及靶向治疗提供实验基础和理论依据。第二部分OTSSP167在慢性淋巴细胞白血病的抗肿瘤效应及机制研究目的:本研究旨在研究OTSSP167对慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞增殖、凋亡、周期、趋化作用及药物敏感性等生物学功能的影响,进一步探究OTSSP167在CLL中发挥抗肿瘤疗效的生物学机制。材料与方法:1.临床标本收集;2.外周血单个核细胞分离;3.免疫磁珠分选CD19+B细胞;4.细胞培养;5.蛋白提取及免疫印迹(Western Blotting);6.细胞免疫荧光;7.公共数据平台高通量基因表达数据提取、生物信息学分析;8.FoxM1 shRNA敲减慢病毒转染CLL细胞;9.FoxM1过表达慢病毒转染CLL细胞;10.Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖;11.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;12.PI/RNase法检测细胞周期;13.Transwell法检测CXCL12诱导细胞趋化,流式细胞仪细胞计数;14.统计学分析。结果:1.递增浓度梯度OTSSP167处理CLL原代细胞、CLL细胞株(MEC1和EHEB细胞)后,与DMSO对照组相比,OTSSP167组CLL细胞增殖活性呈时间、浓度依赖性明显降低(p<0.05),凋亡细胞明显增加(p<0.05),G2/M期细胞显著增多(p<0.05),CXCL12趋化细胞数减少(p<0.05),对氟达拉滨及依鲁替尼药物敏感性增高(p<0.05)。2.Western blotting结果显示,与DMSO对照组相比,递增浓度梯度(20nM、40nM、80nM)OTSSP167处理MEC1、EHEB,p-AKT及p-ERK表达量明显下降,AKT和ERK总表达量无明显差异变化。3.Western blotting和细胞免疫荧光结果显示,与DMSO对照组相比,递增浓度梯度(20nM、40nM、80nM)OTSSP167处理MEC1 和EHEB细胞后,FoxM1、p-FoxM1及下游分子cyclinB1、CDK1表达明显降低,MEC1中p53表达量无明显变化,EHEB中p53明显增加,两种细胞中p21表达量增加。FoxM1敲减慢病毒转染及FoxM1抑制剂Thiostrepton处理MEC1细胞后,OTSSP167对CLL细胞的活性抑制作用增加(p<0.05)。FoxM1过表达可减弱OTSSP167对CLL细胞的增殖抑制(p<0.05)。结论:上述研究证实,OTSSP167可抑制CLL细胞增殖,诱发凋亡和细胞周期阻滞,减弱细胞趋化能力和提高细胞对氟达拉滨和依鲁替尼的药物敏感性。同时,OTSSP167通过调控FoxM1的表达和磷酸化发挥高效抗白血病作用,为提高CLL的疗效提供新的治疗策略。