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目的:观察研究SR-BI上C323位点突变后,对介导细胞选择性摄取胆固醇酯及游离胆固醇释放作用的影响,以进一步明确SR-BI上C323位点在SR-BI功能发挥中的作用。方法:1.免疫印记(Western Blot)检测细胞株SR-BI表达情况。2.1.通过Caveolae Prep.,从蛋白水平检测变异细胞株SR-BI的分布情况。2.2.用免疫荧光标记细胞株SR-BI,通过共聚焦显微镜观察变异细胞株SR-BI分布情况。2.3.通过生物素技术,标记变异细胞株细胞表面SR-BI,明确变异细胞株细胞表面SR-BI分布状况。3.1.改进iodine monochloride method法[1],用125I标记HDL,改进Gwynne and Mahaffee文献中所述方法[3],用3H标记125I-HDL。3.2.使用同位素示踪技术,检测SR-BI介导细胞选择性摄取胆固醇酯情况,使用γ-计数器读取125I放射活性值,使用β-计数器读取3H的放射活性值。3.3. BCA法测定同位素样品中的细胞蛋白浓度。4.参考Nancy Webb文献中所述方法[3] ,使用3H标记胆固醇,同位素示踪细胞内游离胆固醇释放情况,使用β-计数器读取3H的放射活性值。5.酶切法切除SR-BI上糖基,应用免疫印记法检测酶切后SR-BI分子量的大小。结果:1.免疫印记结果:CHO-SR-BIC323G细胞株与阳性组细胞CHO-SR-BI一样,表达SR-BI,分子量为75KD;变异细胞株还表达分子量为100KD的SR-BI,其表达量少于分子量为75KD的SR-BI。2.1.Caveolae Prep.结果:在细胞内,CHO-SR-BIC323G细胞株中的SR-BI与caveolin-1蛋白分布位置相同:均在代表细胞膜成分的PNS和代表Caveolae成分的CM里表达。2.2.免疫荧光标记后的细胞在共聚焦显微镜下显示:CHO-SR-BIC323G细胞株的SR-BI与CHO-SR-BI细胞株SR-BI分布位置相同,均与caveolin-1蛋白分布位置一样,位于细胞膜上的Caveolae内。2.3.生物素实验:CHO-SR-BIC323G细胞株与阳性对照CHO-SR-BI细胞株一样,在细胞表面有SR-BI的表达。3.1.表示细胞中SR-BI与HDL结合量的125I放射活性值: CHO-SR-BIC323G细胞株与CHO-SR-BI细胞株两两比较,CHO-SR-BI细胞株的125I放射活性值明显高于CHO-SR-BIC323G细胞株,有统计学意义,P<0.05;与CHO-vector细胞株两两比较,CHO-SR-BIC323G细胞株125I放射活性值稍高于CHO-vector细胞株,有统计学意义,P<0.05;3.2.表示SR-BI介导细胞选择性摄取胆固醇酯的3H放射活性值: CHO-SR-BIC323G细胞株与CHO-SR-BI细胞株两两比较,CHO-SR-BI细胞株明显高于CHO-SR-BIC323G细胞株,有统计学意义,P<0.05;与CHO-vector两两比较,CHO-SR-BIC323G与CHO-vector相同,无统计学意义,P=0.184。4.SR-BI介导游离胆固醇释出的平均百分比:在各个时间点上,CHO-SR-BI细胞株明显高于CHO-SR-BIC323G细胞株,两两比较有统计学意义,P<0.05,CHO-SR-BIC323G细胞株与CHO-vector两两比较,二者相同,无统计学意义,P=0.119。5.CHO-SR-BIC323G细胞株中SR-BI去糖基后,其分子量与阳性对照CHO-SR-BI细胞株SR-BI去糖基后分子量相同,为56KD。结论:1. C323位点是SR-BI上的关键位点,在SR-BI介导细胞选择性摄取胆固醇酯及游离胆固醇释放过程中,是不可缺少的。2.C323位点的突变未改变SR-BI在细胞内外的分布位置。3.SR-BI上C323位点突变后,其介导细胞选择性摄取胆固醇酯及游离胆固醇释放的能力显著下降。