研究背景近年来随着心血管病患病率的持续上升,冠心病、肺心病、心力衰竭等疾病对居民生活的影响不容小觑,心血管病相关的心肌纤维化、心室重塑等改变也越来越被临床研究所重视,且不仅在心脏疾病中,糖尿病人群也会出现血糖相关的心肌纤维化。心肌纤维化的病理生理改变是细胞外基质成分在心肌间质中过量沉积,导致心室壁弹性减弱,收缩及舒张功能受损,最终引起心力衰竭。细胞外基质沉积包括胶原增生、成纤维细胞大量增殖两方面,在心血管疾病的晚期,异常增生的胶原纤维相互交联,加重心肌纤维化。因此,预防心肌纤维化和减缓其进展,在慢性心脏疾病的治疗中具有重要的临床意义。心肌纤维化的机制错综复杂,相互影响,在对心肌纤维化信号通路的研究中发现,TGF-β是促纤维化过程中最重要的分子,被认为是心肌梗死后,组织由炎症反应向瘢痕组织转变的开关,其通过Smad蛋白依赖通路和非Smad蛋白依赖通路,刺激细胞因子和信号通路,进而影响胶原纤维等成分改变。TGF-β家族中,研究最多的是TGF-β。TGF-β是一个多效因子,其生理功能即使在同样的细胞里也有可能不同,甚至相反。目前发现哺乳动物中TGF-β有3种亚型,TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,3种亚型在体内具有不同的功能。TGF-β和TGF-βR结合后,可激活下游的信号分子级联反应,参与分化、凋亡、炎症反应等过程。在TGF-β信号通路中,以Smad蛋白依赖的经典通路为主,活化的TGFβR与R-Smad蛋白结合,最终移位到细胞核内,调控靶向基因的转录过程。除此以外,不依赖Smad蛋白的信号通路在TGF-β反应中也有重要的作用,目前已发现的非经典信号通路有ERK-MAPK信号通路、TAK1介导的JNK/p38MAPK信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路等,这些信号通路通过与活化的TGF-β受体结合后级联调控,参与TGF-β介导的上皮间质转换、凋亡、纤维化等过程。除了介导信号通路,TGF-β还通过与其他的细胞因子互相作用,参与促纤维化的过程。因此,作为心肌纤维化中的主要因子,对抗TGF-β及其介导的信号通路无疑成为防范心肌纤维化进展的重要靶点。丝裂原活化蛋白激酶MAPK介导的p38MAPK信号通路在早期即发现有促进胶原纤维合成的作用,经典的MAPK是一个三级级联磷酸化过程,活化的TGF-βR激活TAK1,即MAP3K后,下游的MKKs、p38被依次磷酸化激活,调控Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。粒细胞集落刺激因子G-CSF是一种有效的干细胞动员剂,通过募集血液中的骨髓干细胞,并动员到心肌坏死部位后,分化为血管内皮细胞,促进血管再生,减少凋亡细胞表达,在急性心梗、心力衰竭方面发挥保护心脏的作用。G-CSF动员干细胞治疗心梗后心肌纤维化的机制目前主要集中于Smad依赖的信号通路,而对于非Smad依赖通路是否有调控作用目前尚不清楚。研究目的以Wistar大鼠为研究对象,异丙肾上腺素Iso构建心肌纤维化模型后,给予G-CSF皮下注射,观察动员治疗对大鼠心肌纤维化的影响。检测心肌组织中TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达情况,探讨G-CSF对抗心肌纤维化的可能机制,为干细胞动员在临床上的应用提供科学依据。研究方法1.22只Wistar大鼠标号,每日固定时间背部皮下注射Iso4mg/kg-1.d-1,连续10天,构建心肌纤维化模型;2.20只大鼠随机分为对照组(control group)和动员组(GT group),G-CSF用生理盐水稀释后,动员组背部皮下注射G-CSF 50μg/kg-1.d-1,连续5天,对照组皮下注射生理盐水,末次给药结束后正常喂养4周;3.动员前及动员后第5天,尾静脉采血稀释后用血细胞计数仪检测外周血白细胞个数;4.动员第5天,大鼠尾静脉采血后,使用密度梯度离心法低温高速离心,吸取单个核细胞层后,用于细胞培养以及细胞的流式鉴定;5.大鼠取材前一天行心脏超声,了解心脏功能;6.所有大鼠麻醉后,腹主动脉采血后静置,高速离心后取上层血清分装,用于Elisa检测BNP含量;7.大鼠心脏在最大横径下方约2mm处横切,上半部分置于多聚甲醛中固定,下半部分剪去右心室及室间隔部分,置于冻存管内液氮冻存;8.心肌组织在固定24h后,用于HE染色、Masson染色以及免疫组织检测;9.Western Blot 检测心肌组织中 ColI、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达。实验结果1.Iso诱导大鼠心肌纤维化改变Iso连续皮下注射10天后,心肌组织HE染色显示,正常大鼠心肌结构整齐无异常胶原增生,注射Iso的大鼠心肌细胞结构错乱,间质胶原纤维大量增生,成纤维化改变。2.外周血粒细胞检测和鉴定G-CSF能动员骨髓中的造血干细胞和骨髓干细胞,因此可通过计数外周血白细胞WBC的数量,了解骨髓动员的情况。根据WBC计数结果,GT组在动员治疗前后,外周血粒细胞数量明显升高,组内比较有显著性差异(P<0.01);动员第5天后,GT组的粒细胞计数较对照组相比也明显升高,组间有显著差异(P<0.01);而对照组在动员前后,外周血粒细胞计数无明显变化。对动员第5天的外周血分离培养后,行流式细胞检测结果显示:外周血粒细胞表面标志CD29、CD90强阳性,CD45阴性,符合骨髓干细胞表面抗原表达的特点,由此证明粒细胞刺激因子动员后,外周血中的单个核细胞主要是骨髓干细胞。3.血清Elisa检测BNP含量动员治疗后,大鼠血清BNP的含量在GT组低于对照组,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。4.心肌病理学形态检测Masson染色显示与对照组相比,GT组心肌间质的胶原沉积程度显著减轻;使用Image-pro软件测量并计算胶原容积分数CVF值,GT组CVF值低于对照组,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。5.心肌III型胶原纤维表达情况心肌组织免疫组化结果显示:对照组心内膜下可见明显阳性表达,Ⅲ型胶原蛋白在间质内弥漫性增生;GT组阳性表达减少,胶原蛋白沉积减轻。6.Western Blot 检测心肌组织 Col I、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达与对照组相比,GT组的I型胶原蛋白表达减少,纤维化程度减轻;TGF-β、TAK1蛋白以及MKK3、p38MAPK蛋白表达下降,用Image-pro软件对两组蛋白条带进行测量后显示,两组间蛋白表达差异P<0.05,差异具有统计学意义。实验结论1.Wistar大鼠皮下注射Iso 4mg/kg-1.d-1,连续10天,大鼠心肌组织能观察到明显的纤维化改变,该建模方式稳定,且动物存活率高。2.心肌纤维化的大鼠在G-CSF动员治疗后,外周血的干细胞数量明显升高,并且升高的细胞以骨髓干细胞为主。3.G-CSF动员治疗可以改善心肌纤维化大鼠的心脏功能,并且减少间质的胶原纤维沉积,减轻心肌纤维化的程度。4.通过检测心肌组织的TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达发现,GT组的TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK蛋白表达减少,初步证实G-CSF动员干细胞对抗心肌纤维化的机制是通过抑制TGF-β介导的TAK1-MKK3-p38MAPK 通路实现的。