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背景肝脏是一个具有完全再生能力的器官,其这一功能有助于缓解化学或创伤性损伤引起的肝功能障碍。miRNA参与了机体一系列的生理及病理过程,如细胞的分化、机体的代谢、免疫应答,炎症及肿瘤的发展。同样,部分miRNA在肝再生的过程中也发挥重要调节作用。miR-149 前体可以产生 miR-149-5p(miR-149)和 miR-149-3p(miR-149*)两条活性链,分别发挥不同的生物学功能。我们通过构建小鼠的肝部分切除(Partial hepatectomy,PHx)实验模型,探索miR-149在肝再生中的作用及其机制。目的探索miR-149以及潜在靶基因对肝再生过程的影响,深入了解miR-149在肝再生过程中的作用及机制。方法1.研究miR-149*-/-小鼠和正常WT小鼠肝再生能力的差异(1)对8周龄的WT与miR-149*-/-小鼠执行2/3 PHx,分别于术后0h,40 h和5d时间点处死。绘制肝再生率曲线,Ki-67免疫组织化学染色,RT-PCR检测与肝细胞增殖相关基因Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A2、p21和p27 的 mRNA 水平,Western blot 检测p-Akt的蛋白表达量,以比较肝再生的能力的差异。(2)对48周龄的两类小鼠执行同样的PHx,利用同样的方法检测肝再生能力水平的变化,同时探究与8周龄小鼠相比肝再生能力的差异。2.探究miR-149和miR-149*对肝脏再生的影响(1)将 NC agomir、miR-149 agomir 和 miR-149*agomir 经尾静脉注射到不同组的 8周龄的WT小鼠体内,24 h后执行2/3 PHx,分别于术后0h,36 h处死小鼠。(2)绘制肝再生率曲线,Ki-67免疫组织化学染色,RT-PCR检测与肝细胞增殖相关基因 Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A2,Western blot 检测 p-Akt 的蛋白表达量,以比较不同组肝再生能力的差异。3.寻找miR-149发挥作用的靶点利用TargetScan、Pictar、miRDB等网站寻找可能的靶点基因,构建包含结合位点的Luciferase质粒,通过双荧光素酶实验在人肝星型细胞LX2细胞内加以验证。通过Luciferase野生型和突变型质粒,验证miR-149与靶点结合的准确性。4.探究miR-149在肝脏再生时期发挥作用的阶段对8周龄的WT小鼠执行2/3的PHx,分别于术后0h、1h、4h、6h和12h处死。RT-PCR检测miR-149和靶基因PHLPP2 mRNA水平变化情况;Western blot检测不同时间点的PHLPP2与p-Akt蛋白表达情况。5.研究靶点基因在肝脏再生期间的作用(1)检测上述miR-149*-/-与过表达miR-149小鼠模型中PHLPP2基因mRNA水平。(2)构建PHLPP2过表达质粒,利用流体动力学将质粒经尾静脉注射到8周龄的WT小鼠体内,24 h后执行2/3 PHx,分别于术后0h,40 h,5d处死。(3)绘制肝再生率曲线,Ki-67免疫组织化学染色,RT-PCR检测与肝细胞增殖与凋亡相关基因Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A2、FOXO3,BAD的 mRNA 水平,Western blot检测p-Akt的蛋白表达量,来比较pcDNA3.1对照组和PHLPP2实验组再生的能力。结果1.不同年龄段WT小鼠和miR-149*-/-小鼠肝再生能力的差异(1)在年轻和老年小鼠中,miR-149*-/-小鼠的肝脏再生率明显低于WT小鼠。(2)Ki-67染色后发现miR-149*-/-小鼠的肝细胞分裂能力较弱。(3)miR-149*-/-小鼠肝脏组织中促增殖相关基因表达水平降低,抑增殖相关基因表达水平升高。(4)miR-149*-/-小鼠的Akt蛋白磷酸化含量降低,说明miR-149*-/-小鼠在不同年龄段中的肝脏再生能力都弱于WT小鼠。2.miR-149和miR-149*对肝脏再生的影响(1)在PHx术后36 h时间点,miR-149组的再生率明显高于NC组,而miR-149*组的再生率则没有显著性差异。(2)miR-149组的促增殖基因明显高于NC组,而miR-149*组的则没有显著性差异。(3)免疫组化染色后发现,miR-149组的Ki-67阳性细胞数目明显高于NC组。(4)miR-149组的Akt蛋白磷酸化水平高于NC组,说明在肝脏再生中,miR-149发挥促进效果,而miR-149*不发挥作用。3.miR-149在肝再生期间调控Akt蛋白磷酸化(1)寻找miR-149的靶基因,发现PHLPP2基因mRNA的3’UTR含有与miR-149种子区存在潜在结合能力的位点。(2)Luciferase实验结果表明,miR-149能够降低PHLPP2重组载体的双荧光素酶活性,提示PHLPP2是miR-149的直接靶基因。(3)在LX2细胞中,过表达miR-149能够明显降低PHLPP2基因的mRNA和蛋白水平。4.miR-149与靶基因PHLPP2在肝再生早期阶段对肝再生的影响(1)PHLPP2的mRNA和蛋白质与miR-149的表达量呈负相关。(2)肝脏再生早期,miR-149表达升高后,抑制了PHLPP2的表达,进而促进下游Akt的磷酸化,从而促进肝脏再生。(3)miR-149*-/-年轻鼠和老年鼠中PHLPP2表达量的上调,说明miR-149*-/-小鼠较弱的再生能力可能与PHLPP2基因表达水平的异常升高有关。5.PHLPP2对肝脏再生的影响(1)过表达PHLPP2的小鼠肝脏再生率明显低于pcDNA3.1对照组小鼠。(2)Ki-67染色表明PHLPP2小鼠的肝细胞分裂能力较弱。(3)过表达PHLPP2能够抑制促增殖相关基因的表达,同时上调抑增殖相关基因的表达水平。(4)PHLPP2小鼠的Akt蛋白磷酸化含量降低,说明PHLPP2作为Akt的磷酸化负调节剂,在肝脏再生阶段发挥抑制作用,不利于肝脏的有效再生。结论1.不同年龄段miR-149*-/-小鼠肝脏再生能力均表现不良。2.过表达miR-149可以促进PHx后的肝脏再生。3.miR-149靶向抑制PHLPP2以诱导Akt活化并促进PHx后的肝再生。