博落回（Macleaya cordata（Willd）R.Br.）系罂粟科（Papaveraceae）博落回属植物,味苦性寒,有大毒,具有杀虫、祛风解毒、散瘀消肿之功效,主要用于治疗跌打损伤、风湿关节痛等。博落回目前已被开发为抗腹泻药物用于临床,同时也作为我国首个二类中药饲料添加剂被广泛应用。虽然博落回被列为具有大毒的中药,但关于博落回毒性的研究少有报道,尤其尚无其毒性物质基础及毒性机制的研究,使得博落回的毒性隐患始终存在。鉴于此,本研究采用毒性追踪的方法,阐明博落回毒性物质基础,并对关键毒性成分进行评价;在此基础上,采用转录组学方法对其毒性机制进行探讨,揭示其神经毒性的机制。本课题主要涵盖以下几个方面:1、博落回毒性物质基础筛选本研究采用小鼠急性毒性试验进行毒性筛选,在确定博落回醇提物具有毒性的基础上,采用毒性追踪的模式,首先确定博落回乙醇提取物的正丁醇萃取物是其毒性部位,进一步反复硅胶柱层析、制备HPLC追踪到2个主要毒性成分,通过HR-MS、~1H-NMR和13C-NMR鉴定为原阿片碱和别隐片碱,其中原阿片碱是主要毒性成分。2、原阿片碱体内一般毒性评价。首先采用经典的寇氏法,测得小鼠口服原阿片碱半数致死剂量(LD50)是313.10 mg/kg,属于强毒化药。依据LD50,分别确定急性、慢性毒性试验小鼠的给药剂量。观察原阿片碱攻毒后小鼠体重、脏器系数、一般行为学、常规生化指标、病理损伤（光学病理学和超微结构观察）、氧化-抗氧化指标的变化,评价原阿片碱体内急性、慢性毒性特点。（1）原阿片碱体内急性毒性评价。（1）与对照组相比,原阿片碱（62.6 mg/Kg/d）攻毒一周,小鼠体重显著减轻（P＜0.05）、脑脏系数升高（P＜0.05）、热痛阈值增加、步态不稳、共济失调、脑出血水肿、神经细胞变性坏死等神经毒性损伤。（2）与对照组相比,原阿片碱攻毒第3-5天,小鼠血清中ALT、AST、BUN、Cre、LDH显著升高（P＜0.05）;H＆E染色结果显示,不同剂量组小鼠显示不同程度的肝、肾损伤,表现为肝细胞气泡样变性、炎细胞浸润、肝细胞坏死;肾脏肾小管淤血、扩张等急性肝、肾损伤。（3）原阿片碱攻毒一周小鼠出现胃肠胀气。H＆E染色结果显示,充血,炎性细胞浸润,粘膜水肿,上皮细胞损伤等病理变化。16Sr-RNA和ITS高通量测序结果显示,原阿片碱染毒一周主要影响肠道细菌的变化,降低细菌的丰度,显著改变菌群组成,尤其是乳杆菌科丰度显著升高。（4）超微结构观察显示:线粒体、内质网、高尔基体病变、细胞凋亡,自噬参与原阿片碱诱导的脑、肝、肾组织损伤。（5）与对照组相比,原阿片碱（62.6 mg/Kg/d）攻毒一周血清、脑、结肠中T-SOD、GSH、CAT的活性显著下降,MDA活性显著升高（P＜0.05）。氧化应激参与原阿片碱引起的神经细胞变性坏死、结肠炎损伤。（2）原阿片碱体内慢性毒性评价。原阿片碱（7.3 mg/Kg/d）连续给药60天,小鼠出现学习、记忆障碍;心肌肥大、心肌炎;轻微的脂肪肝病变;肺炎等慢性毒性。氧化应激、线粒体病变参与原阿片碱诱导的慢性神经毒性以及心脏毒性。3、基于转录组学探讨原阿片碱诱导的神经毒性机制取原阿片碱（62.6 mg/Kg/d）攻毒一周小鼠脑组织和对照组脑组织进行高通量转录组测序。共获得了156个差异表达基因（DEGs）。这些差异表达基因经GO富集分析后,主要集中在生物学过程的动物器官形态发生上。KEGG富集分析,与神经系统相关的胆碱能突触、多巴胺能突触、突触囊泡循环通路,松弛素信号通路以及与血脑屏障相关的紧密连接、细胞粘附分子（CAMs）等信号通路呈显著富集。随机选择13个DEGs,包括6个胆碱能突触（chrm5、slc18a3、slc5a7、Creb3i1、chrnb4、Kcnj14）基因、5个紧密连接（cldn1、cldn2、cldn9、Rab13、Unc13b）基因以及2个显著变化差异基因（Plcz1、Lefty1）采用q RT-PCR进行验证,q RT-PCR基因表达变化趋势与转录组结果相一致,证明转录组结果准确可靠。4、通过紧密连接和胆碱能突触神经通路揭示原阿片碱神经毒性机制通过q RT-PCR以及Western blot法检测小鼠急、慢性脑、结肠组织以及PC12细胞中胆碱能突触以及紧密连接基因和蛋白的表达变化。并通过试剂盒检测了组织、血液以及细胞中Ach E含量的变化。结果表明,原阿片碱暴露,小鼠脑和结肠组织中cldn1、cldn2、cldn9、slc18a3、slc5a7、chrnb4基因和蛋白均显著减低（P＜0.05）,chrm5基因和蛋白显著升高（P＜0.05）,小鼠脑和血液中Ach E含量显著降低（P＜0.05）,但是结肠中Ach E含量显著升高（P＜0.05）。不同浓度（2.28、1.14、0.56、0.28、0.14、0.07、0.04、0 m M）原阿片碱染毒PC12细胞,其细胞毒性呈现剂量依赖性增加。暴露于原阿片碱（1.14 m M）的PC12细胞中的slc18a3、slc5a7、chrnb4基因和蛋白显著减低（P＜0.05）,chrm5基因和蛋白显著升高（P＜0.05）,细胞中Ach E含量显著降低（P＜0.05）。结果表明胆碱能突触、紧密连接通路介导原阿片碱诱导的体内体外神经毒性。综上,博落回主要毒性物质基础是原阿片碱,LD50达313.10 mg/Kg,造成肝、肾、脑、心、结肠等多个脏器损伤。原阿片碱短期高剂量暴露引起体重减轻、感觉功能及运动功能失调等神经毒性症状,病变部位在大脑皮层、海马区,线粒体、内质网、高尔基扩张、细胞凋亡介导神经细胞水肿、变性坏死,经转录组学分析,胆碱能突触、紧密连接通路显著富集。基于组学结果,进一步体内、体外研究揭示了胆碱能突触、紧密连接通路障碍参与原阿片碱诱导的神经毒性损伤。