热泉微生物及其氢酶多样性研究

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深海热液和浅海热泉是嗜热氢酶最主要的发源地。微生物发酵是氢气生产的一种重要技术,在深海热液环境中产氢的微生物是嗜热的和耐盐的,目前已经调查和研究的嗜热环境均分布着嗜热的氢还原或者氢氧化的细菌,因此热泉仍然蕴藏着大量未知的、有可能培养的产氢酶微生物。本论文对印度洋卡利安达岛海洋热泉周边的微生物群落进行了分析,采集了热泉周边的海水样品、菌苔和沉积物,通过扩增构建热泉微生物的总16SrRNA基因库,分析热泉微生物的多样性。结果表明热泉周围不同样品具有很高的微生物类群多样性,大部分序列与已知细菌16S rDNA序列相似性较高(88%~100%),归属于变形细菌的α-变形菌纲、β-变形菌纲、δ-变形菌纲、γ-变形菌纲,壁厚菌门的梭菌纲、芽孢杆菌纲,脱铁杆菌纲,疣微菌纲,蓝细菌等系统分类群,其中变形细菌的γ-变形菌纲(占总克隆的41.88%)、β-变形菌纲(占总克隆的19.23%)、α-变形菌纲(占总克隆的8.97%)为热泉周边海水的优势细菌类群。蓝细菌的Chroobacteria(占总克隆的55.29%)、拟杆菌门的拟杆菌纲(占总克隆的13.53%)、α-变形菌纲(占总克隆的10%)是菌苔微生物群落中的优势细菌类群。脱铁杆菌纲(占总克隆的28.21%)、变形细菌的α-变形菌纲(占总克隆的12.85%)、γ-变形菌纲(占总克隆的10.03%)、β-变形菌纲(占总克隆的8.78%)、δ-变形菌纲(占总克隆的8.78%)是海洋热泉沉积物的优势细菌类群。利用不同氢酶引物,以环境DNA为模板进行扩增,构建氢酶基因文库,分析热泉微生物氢酶的多样性。利用三对引物以菌苔DNA和沉积物DNA为模板都得到了目的扩增片段,对目的片段进行回收连接转化。以HydA F/HydA R为引物得到的基因库,经过比对,HKM样品中得到了6个不同的基因型,HKS样品中得到了4个不同的基因型,样品HKM和样品HKS所获基因的覆盖率分别是98.04%和97.62%,都与Ignavibacterium album JCM16511FeFe氢酶类群的菌氨基酸序列有75%-96%的相似性。Ignavibacterium album是在陆地温泉的微生物藻床分离得到的嗜温化学异养的细菌。这些FeFe氢酶类群的菌氨基酸序列之间的进化关系在72%-99%。以FeFe-272F/FeFe-427R为引物得到的基因库,经过比对,泥样有14种基因型,其覆盖率为62.3%;菌苔(FeM)样品中得到24个基因型,其覆盖率达到65.2%。以HoxH-f/HoxH-r为引物得到的基因库,结果得到菌苔样品中有7种基因型,其覆盖率达到65%;泥样样品中有1种基因型,其覆盖率为95%。目前还没有对利用Fe–Fe氢酶产氢的嗜热菌环境的报道。本论文对从温泉海藻床的几个菌群利用全营养培养基进行富集培养,并对其产氢进行分析。通过对16S rRNA基因分析得到了产氢群,并对富集菌群的Fe–Fe氢酶的多样性进行了分析。基于16S rRNA基因序列系统发育分析:在产氢菌群中有10个类群与梭菌属(Clostridia)、Gammaproteobacteria和芽孢杆菌目(Bacillales)中的的已知种属有90-99.5%的相似性。梭菌属是最多的的一组,其中有已知的产氢种属三个梭菌类群(Anaerovorax odorimutans (94.0%相似性),Clostridium papyrosolvens(98.4%相似性)和Clostridium tepidiprofundi (93.1%相似性)。Fe–Fe氢酶系统发育分析:有7个类群和已知Fe–Fe氢酶有63-97%的相似性,分为不同的四个簇,HW55-3和HM55-1分别是是嗜热和耐盐的梭菌属,基于16S rRNA和Fe–Fe氢酶基因序列的分析都表明了嗜热、耐盐的热泉海藻床产氢菌群都是从未发现的产氢微生物来源,在氢气生产方面有着很大的潜力。
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